苹果炭疽叶枯病菌与寄主互作分子致病机理研究进展

翟 浩，李晓军，余贤美，王海波，马亚男

(山东省果树研究所，山东泰安 271000)

植物真菌病害可造成巨大的产量损失，且一直威胁全球的食品安全[1-2]。培育和种植抗病品种是控制植物真菌病害较为有效且环保的方法[3]。目前，从分子和遗传学角度对植物病原真菌进行了较为深入的研究，揭示了大量真菌的分子致病机理[4-5]。

苹果炭疽叶枯病(Glomerellaleaf spot,GLS)是由刺盘孢属(Colletotrichum)真菌引起的苹果部分栽培品种的叶部病害，近年来该病害在我国各苹果产区普遍发生，可造成苹果树叶片大量脱落和果实腐烂，进而削弱树势，引起次年果实减产甚至绝产，严重制约了苹果产业的健康可持续发展[6]。深入研究苹果炭疽叶枯病菌的分子致病机理，有助于分析苹果炭疽叶枯病发展迅速、危害严重的原因，为针对该病害的药剂研发和果园管理措施优化提供参考，同时为研究其他病原菌与植物的互作机制提供理论依据。

1 苹果炭疽叶枯病研究现状

苹果炭疽叶枯病是我国近年来新发现的一种流行性病害，主要危害嘎啦和金冠系列苹果品种。Wang 等[7]对我国苹果炭疽叶枯病的症状和病原进行了首次报道。目前，该病害逐渐蔓延，在山东、陕西、辽宁、河南和河北等主要苹果生产省份已普遍发生[6]。

苹果炭疽叶枯病最初被认为由围小丛壳(Glomerellacingulata,无性态为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides)引起[8]。后经研究发现，尖胞炭疽菌(C.acutatum)[9]和喀斯特炭疽菌(C.karstii)[10]也可引起苹果炭疽叶枯病。王薇等[11]根据新的刺盘孢分类系统[12]，利用形态学、培养特性、多基因系统发育及致病性等特征，明确了河南省和陕西省部分苹果产区苹果炭疽叶枯病的病原为果生刺盘孢(C.fructicola)和隐秘刺盘孢(C.aenigma)2种。通过对山东省苹果主产区苹果炭疽叶枯病病原的形态学研究和多基因系统发育分析，认为引起该地区苹果炭疽叶枯病的病原为果生刺盘孢(C.fructicola)。

近年来，国内外对于苹果炭疽叶枯病的研究集中于病原群体结构、病原侵染机制、病害发生规律和药剂防治等。符丹丹等[13]利用优化后的ISSR-PCR反应体系对苹果炭疽叶枯病菌遗传多样性进行分析。任斌等[14]利用光学显微镜和扫描电镜对围小丛壳(G.cingulata)在嘎啦苹果叶片上的侵染过程进行了研究，认为该菌发育和侵染过程中的一些特点可能是造成病害暴发的原因。王冰等[15-16]检测了6种药剂对围小丛壳的内吸治疗效果和8种药剂的保护效果，并测试了温度、湿度和光照对该菌产生分生孢子和子囊孢子的影响。王海艳等[17]和张俊祥等[18]建立并优化了农杆菌介导的围小丛壳的遗传转化体系，吴建圆等[19]利用农杆菌介导的转化技术将nptⅡ(新霉素磷酸转移酶基因)基因盒整合到围小丛壳基因组中，韩小路等[20]建立了聚乙二醇介导的果生刺盘孢(C.fructicola)原生质体的转化体系。

目前，从分子角度对苹果炭疽叶枯病菌与寄主互作机制的研究相对较少。Perfect等[21]认为刺盘孢属(Colletotrichum)真菌是研究植物病原真菌与寄主互作非常理想的模式菌之一。Sygmund等[22-23]对围小丛壳的一个依赖于FAD的葡萄糖脱氢酶基因进行了真核和原核表达，该酶被认为可以抑制植物漆酶、酚氧化酶和过氧化氢酶的活性，在侵染植物过程中可能起促进作用。Seman等[24]利用毕赤酵母对围小丛壳的角质酶基因进行了高效表达。Wang等[25-26]研究认为，茉莉酸、脱落酸和一些芳香挥发物的协同作用在葡萄果实抵御围小丛壳的侵染过程中发挥着重要作用。Velho等[27]研究发现果生刺盘孢可以通过抑制植物的氧化防卫反应来达到在苹果叶片上成功定殖和侵染的目的。虽然这些研究均为苹果炭疽叶枯病菌的研究奠定了一定基础，但对于苹果炭疽叶枯病菌-苹果叶片这个病害系统，病原表达在互作过程中发挥关键作用的蛋白质分子尚未做出明确判断和功能验证。因此，从互作蛋白着手，探讨苹果炭疽叶枯病的分子致病机理，从根本上解析该病害发展迅速、危害严重的原因是十分必要的。

2 植物的先天免疫系统与互作蛋白

植物的先天免疫反应包含2个层面[28]，其中第1个层面是由病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)触发的免疫反应(PAMPs triggered immunity，PTI)。PTI通过植物跨膜的模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)来实现，PRRs可以识别保守的病原相关分子模式，激活寄主植物的第一层免疫反应来抵御入侵微生物的定殖[3,29-30]。植物的PRRs感知PAMPs，会快速启动与PTI相关的一系列反应，包括丝裂原活性蛋白的级联、防卫反应相关基因的响应和细胞死亡等[5,31-32]。植物先天免疫系统的第2个层面是以高度多样化的抗性蛋白(R蛋白)为基础，这些R蛋白可以识别各种病原效应蛋白(effector)，激活植物的免疫反应，即蛋白触发的免疫反应(effector-triggered immunity，ETI)[33-34]。ETI大多在细胞内进行，往往十分迅速和强烈，常会伴随着植物的过敏性坏死反应(hypersensitive reaction,HR)[3]。不同种类炭疽菌的体外基因敲出和回补课题的开展促进了对这类模式病原物的研究和利用[21]，目前已对可侵染模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)和十字花科蔬菜的菜炭疽菌(C.higginsianum)[35-37]和可侵染本氏烟(Nicotianabenthamiana)和烟草(N.tabacum)以及西瓜炭疽菌(C.orbiculare)[38]进行了深入研究。然而，对重要经济作物炭疽病菌的PAMPs和效应蛋白的研究，还远滞后于对这些真菌的次生代谢分析等生物化学方面，到目前为止仅少数几种效应蛋白得到验证[39-42]。

PAMPs能在植物组织表面、植物细胞间隙或植物细胞内起作用[43-44]，通过与寄主细胞的靶蛋白结合，刺激植物快速产生Ca2+、NO和H2O2等早期免疫防御反应信号分子[45]，这些信号分子通过复杂的信号网络进行逐级传递放大，产生乙烯、水杨酸、吲哚乙酸、茉莉酸、植保素和病程相关蛋白等，最终使植物获得系统抗病性[46]。PAMPs与植物靶蛋白的结合在诱导植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用，是揭示激发子诱导植物抗病分子机制的关键环节。研究发现，植物病原真菌的一个内切纤维素酶，具有PAMPs功能，可以诱导植物的防卫反应(植物细胞过敏性坏死反应、植物防卫反应基因表达、活性氧产生、培养基碱化、钙离子积累、乙烯合成等)，并其激发活性与催化活性不相关[32]。具有激发子功能的真菌木聚糖酶、果胶酶和内切纤维素酶等被称为PAMPs分子[5,47-49]。PAMPs涉及各种结构的分子，并在病原种属间保守。较为典型的PAMPs有细菌中的鞭毛蛋白、延伸因子EF-Tu、肽聚糖和脂多糖等，真菌中有细胞壁多聚糖和几丁质等，卵菌中有葡聚糖[50-52]。一般认为PAMPs在微生物适应与生存过程中发挥重要作用[53]。

效应蛋白方面，目前研究证实可以利用病原效应蛋白作为分子探针，筛选鉴定寄主的感病基因(S基因)[54]。感病基因编码蛋白被病原真菌识别，引起病原菌扩散并最终导致植物组织病害。如果使植物感病基因失活，则可以降低病原菌的致病能力，诱导寄主产生持久的抗病性[55]。近10年来，多项研究也证实了这一点，以植物感病基因对病原真菌效应蛋白的识别为基础产生的免疫反应，可以抵御多种病原菌的侵染[54]。

包括苹果炭疽叶枯病菌在内的植物病原真菌都会在侵染寄主过程中表达分泌互作蛋白，尤其是PAMPa和效应蛋白。期望通过对苹果炭疽叶枯病菌-苹果叶片这个病害系统中互作蛋白的筛选与功能验证，寻找保守的PAMPs和效应蛋白分子，分析和讨论苹果炭疽叶枯病菌的分子致病机理。

3 展望

我国是世界苹果生产大国，种植面积和产量均居世界前列。近年来，苹果炭疽叶枯病在全国各苹果产区大范围暴发，严重影响了果实的产量和品质，制约了苹果产业的健康可持续发展。目前对苹果炭疽叶枯病菌分子致病机理和苹果抗病机理的研究尚不充分。以苹果炭疽叶枯病菌为研究对象，从病原-寄主互作蛋白着手，阐述该病菌的分子致病机理，可以为防控药剂研发和管理措施优化提供参考，为该病害防治及抗病品种培育提供新思路。

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