京尼平苷治疗非酒精性脂肪性肝病的潜在生物学效应*

刘 倩 冯 琴 胡义扬 李 爽

1.上海市宝山区中西医结合医院消化内科 (上海, 201900)；2.上海中医药大学肝病研究所

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)目前是世界范围内广泛出现的一个健康问题，影响到全球总人口的25%～30%[1]。它包括非炎症性单纯脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌(HCC)，是与胰岛素抵抗(IR)以及遗传易感密切相关的代谢性疾病。NAFLD患者2型糖尿病、心血管危险因素相关的死亡风险增加，而NASH患者也由于可能进展为肝硬化和HCC而增加了肝脏相关的死亡率。在亚洲NAFLD患者中，有肝活检证实的NASH患病率为63.45%[2]。随着社会发展与生活习惯的改变，NAFLD在我国患病率也进入一个快速增长期，2016年我国NAFLD发病率为5%～24%[3]。虽然限制热量摄入、强化运动或减肥手术等仍是目前治疗方案的最重要部分，但仍没有效果确切的可推荐的干预措施，因此，发现并研究安全有效的NAFLD治疗药物仍具有重大的现实意义。京尼平苷是中药栀子的主要药效成分，具有广泛的生物学效应，越来越多的基础实验证实其可能有助于防治NAFLD。我们利用pubmed及中国知网搜索引擎对2019年5月前发表的治疗NAFLD的有效研究进行了系统检索，以探讨京尼平苷的应用及其对NAFLD治疗效应的可能作用机制。

11 京尼平苷的药理学概述

京尼平苷(C17H24O10)是一种属于环烯醚萜苷类的天然药物成分，易溶于水，可被β-葡萄糖苷酶水解为京尼平和葡萄糖，在自然界中有40余种植物均可分离并鉴定出京尼平苷，而以茜草科植物占多数。京尼平苷主要来源于中药栀子(干重果实中含3.3～8.56%)，另外地黄、杜仲、牛膝等常用中草药也是其基本植物来源(京尼平苷含量超过1.8%)。另外，在2015年版国家药典中，京尼平苷还被列为含栀子的约20种中成药制剂质量评价的定量组分，如八正合剂、龙胆泻肝丸、清开灵软胶囊、牛黄上清软胶囊等[4]，而在治疗肝胆疾病的经典方剂茵陈蒿汤中京尼平苷也是主要的药效成分[5]。京尼平苷为水溶性，一般口服给药，口服后组织分布方面，按药时曲线下面积AUC0→4h值计算口服后组织分别顺序为肾>脾>肝>心>肺>脑[6]。在代谢曲线实验中，正常雄性SD大鼠口服剂量350mg/kg的京尼平苷，鉴定出了33种代谢物，其中，血浆、尿、肾、肝中分别检测到17、31、12、12种代谢产物，还有心、肺、脾、脑也分别检测到了多种代谢产物，其研究结果表明京尼平苷的一个基本代谢途径涉及C-1上羟基的水解，而另一个途径与去甲基化、甲基化、半胱氨酸结合、糖基化和葡萄糖醛酸结合有关[7]。在临床试验中，以尿中京尼平苷的浓度为指标研究其排泄动力学，对临床试验志愿者，静脉注射脑血宁后10h内，尿液中京尼平苷原型的累计排泄量达70%。由此可见，人体中的大多数京尼平苷是通过尿液排泄的[8]。虽然京尼平苷有多种生物活性，但肝毒性是京尼平苷安全的最基本问题，现有毒性研究表明SD大鼠高剂量(>500mg/kg)京尼平苷灌胃给药24～48h后会导致与氧化应激相关的肝毒性，而72.9mg/kg或更低剂量的京尼平苷即使连续口服90天也不会引起肝毒性[9]。因此，在一定剂量范围内，京尼平苷具有多种对人体有益的药理作用，包括抗炎、调节糖脂代谢、抗氧化、神经保护、肝胆保护、免疫调节、抗肿瘤等作用[10]。

2 京尼平苷治疗NAFLD的潜在生物学效应

NAFLD发病过程始于IR，进而肝细胞脂肪变。肝细胞的脂毒性由游离脂肪酸(FFA)及其代谢产物引起，肝脏内的这些变化在线粒体和内质网上产生额外的代谢应激及应激级联反应，包括活性氧的释放和免疫细胞及其他细胞损伤介质的聚集。这些过程可导致进一步的细胞损伤，诱发炎症、细胞凋亡和纤维化[11、12]。京尼平苷治疗NAFLD的相关研究目前集中在基础实验，研究结果显示其对NAFLD有多种有益的生物学效应，包括改善IR、改善糖脂代谢、抗氧化应激、抗炎、抗肝纤维化等。

2.1 改善IR及糖脂代谢 IR是导致NAFLD发病的一个重要因素，可使细胞对葡萄糖的吸收与利用降低，葡萄糖含量升高，脂类过度分解引起循环中的FFA升高，最终脂类的聚集与分解失衡，从而导致脂肪在肝脏细胞中的蓄积。NAFLD及2型糖尿病患者骨骼肌中葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)的表达水平显著降低，表明葡萄糖处理能力下降。有研究者运用HepG2细胞株构建了存在IR的细胞模型，通过观察P62蛋白/核因子(NF)-κB/GLUT-4通路来探讨京尼平苷是否能促进该细胞自噬从而抑制IR。研究结果发现，GLUT-4的表达量在京尼平苷干预后8h下降到最低，京尼平苷促进了IR状态下HepG2细胞的自噬并显著改善了IR，这可能与其动态调节P62/ NF-κB/GLUT-4通路有关[13]。

饮食中过多摄入糖类、脂类或者糖脂代谢失衡都会导致肝脏中脂肪的堆积，而多项研究结果表明京尼平苷对改善肝脏脂质沉积、降低血糖、降低血脂等都有积极的治疗作用，而其相关机制研究也显示出其作用途径多靶点的特点。例如通过观察京尼平苷干预高脂饮食诱导8周的NAFLD模型大鼠的药效指标，发现京尼平苷组大鼠体重、脂肪重量、肝组织FFA和甘油三酯(TG)水平、血清ALT及AST活性均较模型组显著降低，且肝组织病理也有不同程度的改善，其作用机制很可能是通过调节AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)-乙酰辅酶A 羧化酶(ACC)-丙二酰辅酶A-FFA轴来实现的[14]。有研究团队观察京尼平苷对代谢综合征模型(亦称自发性肥胖2型糖尿病模型，TSOD)小鼠的影响，发现口服京尼平苷能减轻TSOD小鼠的体重，改善脂肪代谢异常，并且经肠道菌群代谢后的产物京尼平可直接作用于肝细胞，抑制游离脂肪酸诱导的HepG2细胞胞内脂质积累，并显著增加了过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的细胞内表达，由此得出结论：改善IR及诱导脂质代谢相关基因的表达是其分子机制之一[15]。

除了改善脂质代谢，京尼平苷还具有显著的促进胰岛素分泌、调节血糖的作用。例如，可以通过激活胰高血糖素样肽-1受体/环磷酸腺苷(cAMP)信号通路增强胰岛素分泌[16]；增强葡萄糖刺激胰岛素分泌，并促进大鼠胰岛细胞株瘤细胞株INS-1的葡萄糖摄取和细胞内三磷酸腺苷(ATP)水平，而胰岛素分泌是控制代谢燃料稳态的关键，是抑制胰岛β细胞功能衰竭的关键因素[17]；除此之外，京尼平苷(200和400 mg/kg)能显著降低采用高脂饮食和链脲佐菌素注射液诱导的2型糖尿病小鼠的血糖、血清胰岛素和TG水平，且其显著抑制糖原磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸酶的表达[18]。在代谢性疾病研究领域较火热的叉头框蛋白1(FoxO1)可以调节机体中多种基因的表达，包括与糖脂代谢、IR、胰岛β细胞增殖分化和凋亡、线粒体功能以及细胞自噬密切相关的基因，而蛋白激酶B(Akt)-FoxO1以及AMPK-FoxO1是参与胰岛素诱导糖异生调节的典型途径，京尼平苷可通过调节这两条途径来降低血糖和抑制肝糖原的异生[19、20]。另外，丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)是FoxO1的主要下游直接靶基因，也是磷酸脱氢酶(PDH)激酶之一，如果骨骼肌中PDK4的表达降低，则PDH活性会增加，从而抑制脂肪酸氧化，促进葡萄糖氧化，与对照组相比，京尼平苷降低了高脂饮食喂养小鼠的FoxO1、PDK4、p-PDH的表达，并且经其干预的小鼠表现出改善葡萄糖稳态的能力并可以降低骨骼肌的一般氧化水平，由此推断其调节葡萄糖利用可能与通路FoxO1/PDK4/PDH相关，为代谢性疾病的治疗提供了一种新的策略[21]。

2.2 抗氧化应激损伤 在NAFLD的疾病发展过程中，脂质过氧化及氧化应激是单纯性脂肪肝发展为脂肪性肝炎的一个重要环节，肝脏作为人体代谢器官，其在正常的生理活动中能产生少量氧自由基，但在某些病理状态下，游离原子团产生与清除失衡，导致氧化产物的聚集。譬如，肝细胞中FFA的聚集会增加线粒体内β氧化的反应率，并且使细胞色素P4502E1和P4504A升高，导致肝脏抗氧化系统受抑制并且慢性消耗谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物质，进而造成氧化应激及脂质过氧化损伤。

对于氧化应激的保护作用，非酒精性脂肪肝相关模型实验并不多，在一项研究中研究者以京尼平苷(0.1g/kg/d)或京尼平苷粗提物(2g/kg/d)对大鼠灌胃4d，发现单体或粗体物均可升高肝脏GSH含量和胞浆GSH-S-转移酶GST的活性[22]。另有研究表明京尼平苷在对高脂饮食诱导的NASH模型大鼠有显著药效的基础上，发现其可降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平并抑制P4502E1的表达，增加PPARα的表达，这些作用可能与超氧化物歧化酶的增加和肝脏丙二醛的降低有关，由此可见京尼平苷对高脂饮食诱导NAFLD大鼠肝脏脂肪变性的保护作用可能与其抗氧化作用以及上调PPARα的表达相关[23]。

虽然针对NAFLD氧化应激的实验结果相对较少，但京尼平苷对急性酒精性肝损伤小鼠氧化应激的保护作用显示出了其对抗氧化应激的潜在治疗效应。在对小鼠灌胃给予京尼平苷和联苯双酯后2h再灌以酒精(6.0g/kg)连续7d后，研究者发现京尼平苷显著逆转了酒精性肝损伤小鼠的血清ALT/AST、GSH、GST、葡萄糖过氧化物(GPX)、铜和锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)[24]。

2.3 改善肝细胞炎症 氧化应激过程会导致炎症相关细胞因子的释放并造成细胞损伤。这些细胞因子主要包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和C反应蛋白等，另外TGFβ、IL-1β、IL-8、IL-10等在肝脏炎症发生中的相关炎症因子，而核因子NF-κB不仅与肥胖和IR的激活密切相关，在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中更是起到关键性作用，NF-κB的激活又可诱导TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。

京尼平苷具有强大的抗炎作用，在既往的药理学研究中已经证实京尼平苷可抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞toll样受体4(TLR4)/NF-κB通路中的NF-κB活性，下调TNF-α、IL-1和IL-6的表达从而发挥抗炎作用[25]；能够明显降低CCl4诱导的急性肝损伤小鼠和脂多糖诱导的单核巨噬细胞-1(THP-1)细胞甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)的表达从而抑制IL-6和TNF-α的表达，京尼平苷可作为MeCP2-Hh通路的有效调节剂，具有在炎症性疾病恢复中的潜在特征[26]；通过诱导胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/AKT/ 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的激活，从而保护大鼠的肝脏缺血/再灌注损伤，而其机制也是部分依赖于抑制炎症[27]。

体外实验中，运用油酸和棕榈酸诱导的HepG2脂肪变性模型，有研究者发现京尼平苷同样显著抑制了NF-κB的激活，可能是一种潜在的治疗NASH的药物[28]。在体内实验中，京尼平苷可显著降低db/db小鼠的空腹血清胰岛素、ALT、AST、总胆固醇(TC)和TG水平及促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[29]。另外，通过代谢组学的分析方法还证实京尼平苷的肝细胞保护作用与其抗凋亡作用密切相关[30]。

2.4 抗肝纤维化 肝纤维化是肝细胞炎症及损伤后“伤口”持续的愈合过程，这是由于激活的肝星状细胞导致细胞外基质过度沉积所致，抑制肝纤维化的激活和增殖被认为是治疗肝纤维化的可行方法。有研究者运用CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型，探讨京尼平苷改善小鼠肝纤维化的作用机制，研究结果发现京尼平苷可显著降低血清透明质酸、层粘连蛋白、羟脯氨酸、ALT和AST的水平。同时，京尼平苷可显著降低α-平滑肌肌动蛋白的表达，并使I型胶原α-1沉积减少，在降低细胞存活率的同时引起激活的肝星状细胞G2/M期细胞分裂停滞，其作用机制可能与调节Shh信号通路密切相关[31]。

TGF-β1在肝纤维化发病中起着重要作用，因此有研究团队观察京尼平苷对TGF-β1诱导的AML12细胞的影响，结果发现京尼平苷能显著抑制TGF-β1诱导的Ι型胶原的mRNA和蛋白表达，并且几乎完全阻断了AML12细胞中Smad2/3、细胞外信号调节激酶(ERK)和Akt的磷酸化。由此可见，京尼平苷可能是通过抑制TGF-β/SMAD和ERK/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路从而抑制TGF-β1诱导的肝纤维化上皮间充转化[32]。

2.5 调节胆汁酸代谢及改善胆汁淤积造成的肝损伤 胆汁酸是胆汁内重要的组成成分之一，有约72种胆汁酸构成了人体的胆汁酸谱。胆汁酸的生成和代谢与营养物质、胆汁酸合成相关酶、胆汁酸转运蛋白以及胆汁酸的反馈调节均有着密切的联系，并且法尼酯受体FXR及胆汁酸受体TGR5均是NAFLD的可能治疗靶点。

在相关的药理学研究中，有研究表明京尼平苷可减轻α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的大鼠肝毒性和胆汁淤积，其机制与胆汁酸稳态相关的酶和转运蛋白有关，京尼平苷(25、 50、100mg/kg，口服)可剂量依赖性地阻止ANIT诱导的肝损伤血清标志物的变化，并降低基底外侧胆汁酸的摄取和降低胆汁酸的过量生物合成，增加通过胆汁酸盐输出泵分泌的小管胆汁酸并在体内下调血浆中的胆汁酸，一些重要的受体如FXR、核受体以及FXR诱导的小异二聚体伴侣(SHP)被激活[33]。在另一项研究中，给ICR小鼠以50 mg/kg京尼平苷灌胃，同样观察到ANIT诱导的胆汁淤积和肝损伤被改善，而相关作用机制可能与细胞因子信号转导3(Stat3)和NF-κB的下调有关[34]。

3 结论和展望

综上所述 ，京尼平苷在治疗NAFLD方面具有改善IR、调节糖脂代谢、对抗氧化应激及肝损伤、抗肝细胞炎症、抗肝纤维化，调节胆汁酸代谢并维持胆汁酸平衡等多种潜在生物学效应。但可能由于京尼平苷的毒性报道，使得该药物的研究和开发受到了一定的阻碍，京尼平苷的毒性呈明显的剂量依赖性，在安全剂量范围内，其可发挥的有益药理作用不容忽视。就目前研究结果来看，京尼平苷治疗NAFLD的基础研究仍较少，较5年之前已明显增多，但还有许多有意义的作用机制值得探讨。