濒危药用植物青天葵内生真菌的鉴定及抑菌活性研究

宋利沙 蒋妮 蓝祖栽 郭晓云 张占江

摘要：研究广西青天葵内生真菌的抗菌活性，并筛选出具有抗菌活性的菌株。从广西青天葵植株中共分离得到23株内生真菌，以15种病原真菌为指示菌株，用平板对峙法对分离的内生真菌进行抑菌试验，结果显示，内生真菌MQY-1对多种病原真菌指示菌具有较强的抗菌活性，结合其形态特征和分子生物学分析结果，将其鉴定为Colletotrichum truncatum，证明青天葵中存在一定的抗菌活性物质，为寻找新型抑菌物质提供一定基础。

关键词：药用植物;内生真菌;青天葵;抑菌活性;拮抗真菌;抑菌谱

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）21-0175-04

收稿日期：2019-01-26

基金项目：广西药用植物园青年基金（编号：桂药基201801）;广西科技基地人才专项（编号：桂科AD16380013）;有机药材种植与评价研究团队（编号：桂药创2019007）;中央引导地方科技发展专项（编号：桂科ZY1949023）;广西壮族自治区中医药管理局项目（编号：gzzc1225）。

作者简介：宋利沙（1987—），女，河南鹤壁人，博士，助理研究员，主要从事中药材病虫害防治研究。E-mail：lishasong@126.com。

通信作者：蒋妮，硕士，副研究员，主要从事中药材病虫害防治研究。E-mail：jiangni292@126.com。

青天葵[Nervilia fordii（Hance）Schltr.]属兰科芋兰属植物，别称独叶莲、珍珠叶、天葵、地沙、半边伞、青莲、芋兰等，主要分布在广东、广西和海南等地，生长于海拔400～600 m的山林阴湿处、田边等，首载于《岭南采药录》，为华南地区的特有药材。全草可供药用，性寒味甘，具有润肺止咳、清热解毒、散瘀止痛等功效，主治肺痨咯血、肺热咳嗽、口疮、咽喉肿痛、跌打损伤等症[1-7]。

内生真菌是指在其生活史的某一时期生活在不同植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的一类真菌，普遍定殖在健康植物组织和器官中，种类繁多，分布广泛[8]。近年来的研究表明，从健康药用植物的不同组织器官中可分离到多种内生真菌，采用不同的培养基可筛选出多种能够产生抑制病原真菌的活性物质的内生真菌，如从人参中分离到的2株内生真菌Fusarium sp.PN8和Aspergillus sp.PN17，具有抗菌活性，并可用于发酵制备人参皂苷等成分[9];从印度药用植物黄花稔（Sida acuta）中分离得到的具有抗菌活性的硫色曲霉（Aspergillus sulphureus），可抗金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌[10];Shah等发现，光果甘草的内生真菌腐皮镰刀菌（Fusarium solani）具有抗结核的作用[11];从印度芳香植物柠檬马薄荷（Monarda citriodora）中分离得到28株内生真菌，分别来自11个属，包括镰刀菌、黄曲霉、毛孢霉属（Muscodor）等，具有开发植物生物防治物质的潜力[12];Gupta等发现，姜黄（Curcuma longa）的内生真菌草茎点霉（Phoma herbarum）具有拮抗斑叶病的活性等[13]。本试验从药用植物青天葵的球茎、茎、叶中进行内生真菌分离，并初步筛选出抗菌活性较强的内生真菌菌株，旨在为寻找新的抗菌药物资源提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试指示菌

供试的15种病原真菌分别为三七灰霉病菌（Botrytis sp.）、三七根腐病菌（Fusaium solani）、豆蔻叶斑病菌（Phyllosticta sp.）、香蕉叶斑病菌（Alternaria sp.）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、苦玄参叶斑病菌（Alternaria sp.）、香蕉炭疽病菌（Colltetorrichum sp.）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、三七黑斑病菌（Alternaria panax）、廣西莪术叶斑病菌（Phomopsis sp.）、烟草灰霉病菌（Botrytis cinerea）、三七炭疽病菌（Colltetorrichum gloeosporioides）、艾纳香褐斑病菌（Phoma sp.）、肿节风黑斑病菌（Colletotrichum dematium）、罗汉果叶斑病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum），均是由笔者所在植物病理研究室保存的菌株。

1.1.2供试样品

2018年11月在广西马山县青天葵种植区（108.17°E，23.72°N）采集青天葵健康植株的球茎、茎、叶并进行编号，封存于保鲜袋中，48 h内完成内生真菌的分离。

1.1.3供试培养基

供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，其组成为马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂18.0 g、蒸馏水1 L，用于植物病原真菌培养和菌株拮抗效果测定。

1.2试验方法

1.2.1内生真菌的分离和纯化

采用常规组织分离法，参考Guo等的方法[14]并进行改进，取健康青天葵的根、茎、叶用无菌水洗净，晾干，剪成长宽均为5 mm左右的小块，在无菌操作台上，用75%乙醇表面消毒30 s，0.1% HgCl2消毒3 min，再用75%乙醇表面消毒30 s，最后用无菌水冲洗3次，将根、茎、叶的小块接种于PDA平皿中，于28 ℃条件下恒温培养，待菌落长出，挑取尖端菌丝纯化培养。纯化后的菌株保藏于广西壮族自治区药用植物园病理研究室。

1.2.2内生真菌的抗菌筛选

采用平板对峙法[15-16]进行拮抗真菌的初筛，在直径为9 cm的盛有PDA培养基的平板中央接种直径为5 mm的病原菌组织块，在距该病原菌组织块2 cm 的3个角点处等距离接种生防真菌，以只接种病原菌菌块为对照。每个处理设3次重复，于28 ℃ 条件下恒温培养，7 d后测抑制率大小，筛选出对病原真菌有拮抗作用的内生真菌。复筛与初筛方法一样。

1.2.3内生真菌抗菌谱的测定

抗菌谱测定方法参考“122”节，测量病原菌菌落直径和抑制率;将直径为6 mm的内生真菌菌块组织置于已加入混悬液的PDA固体培养基上，测量抑菌圈直径。

1.2.4内生真菌的鉴定

1.2.4.1形态鉴定

将拮抗真菌在PDA培养基上培养7～15 d，记录菌落形态[17]，在光学显微镜下，观察并记录其分生孢子和子实体结构的形态特征。

1.2.4.2分子生物学鉴定

采用MightyAmp DNA Polymerase Ver.3（1.25 U/50 μL）（TAKARA BIO INC.，Japan，cat. no. R076A）试剂盒，挑取培养拮抗真菌的菌落作为模板直接用于PCR反应。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。扩增反应在50 μL反应体系中进行，包括2×MightyAmp buffer （1×） 25 μL、10×Addtitive for High Specificity（1×） 5 μL、正反引物各1.5 μL（15 pmol），加ddH2O定容至50 μL。PCR反应程序如下：98 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸60 s，40个循环;最后在68 ℃下延伸10 min。空白对照为ddH2O。吸取2.5 μL PCR产物加入1%（W/V）琼脂糖凝胶的孔中，将凝胶置于1×TAE缓冲液中，在130 V下电泳30 min，用凝胶成像法检测目的条带。将有目的条带的PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank中的序列进行BLAST比对。利用MEGA 6.0软件的邻位连接法（Neighbor-Joining法）构建内转录间隔区（ITS）rDNA的系统发育树。

真菌种属地位的确定，依据目标序列和参考序列进行BLAST比对之后，同源性≥95%，将其暂定为同1个属;相似性≥99%，暂定为同1个种。

1.2.5内生真菌菌落形态观察

用光学显微镜观察处理菌株和对照菌株菌丝体的形态特征，拍照并记录。

2结果与分析

2.1内生真菌的分离

通过常规组织分离法，从青天葵的块茎、茎和叶中共分离得到23株内生真菌纯化菌株，其中叶中9株，茎中11株，块茎中3株，可以看出茎的分离率最大，达47.83%，其次是叶（39.13%）和块茎（13.04%）。针对这23株真菌菌株，在不同组织中选出不同的形态类型，共计13株进行分子鉴定（表1）。

2.2内生真菌的鉴定

“2.1”节中的13株菌株经PCR反应和测序得到的序列与Genbank中5株真菌的参考序列相似性达到99%，属于同属不同的种。基于ITS构建的系统发育树（图1）显示，这13株青天葵内生真菌属于5个不同分支，并有较高的支持率。MQY-1、MQY-3、MQJ-2、MQJ-9这4株菌株在同一个分支上，属于平头刺盘孢[Colletotrichum truncatum（KX364059）];MQJ-11和MQJ-12构成一个支持强度很高的分支，属于博宁刺盘孢[Colletotrichum boninense（KX343044）];MQJ-4与暹罗刺盘孢[Colletotrichum siamense（KY421040）]构成一个分支，支持率达到99%;MQKJ-1、MQKJ-2和MQY-6聚类在一起，该类群属于胶孢炭疽菌胶胞刺盘孢[Colletotrichum gloeosporioides（MH790247）]。可见，这13株菌株都属于刺盘孢属（Colletotrichum sp.），占分离总数的56.52%，是青天葵内生真菌的优势菌群。

2.3内生真菌的抗菌活性

以15种病原真菌为指示菌，采用平板对峙法进行青天葵内生真菌的抑菌活性研究，结果表明，23株内生真菌中，只有MQY-1对这15种病原真菌均有较强的抗菌活性，平均抑制率达65.00%（表2），具有抑菌广谱性;其中对烟草灰霉病和三七灰霉病抑制率较高，分别为89.70%、80.00%;而对豆蔻叶斑病、罗汉果叶斑病、香蕉枯萎病和西瓜枯萎病的抑制率较低，分别为51.88%、53.59%、54.02%、55.56%。

2.4抑菌活性菌株的形态特征

MOY-1具有抗菌广谱性，因此，在生物显微镜下对该菌的形态特征进行观察和鉴定。图2显示，该菌株菌落表层有1层白色绒状的菌丝，生长较快，不产分生孢子。综合其形态学特征和分子生物学分析结果鉴定该菌株为C. truncatum。

3讨论与结论

药用植物内生真菌普遍存在于健康植物的不同组织和器官中，种类多样，且分布广泛。青天葵是我国特有的濒危药用植物，在自然条件下生长很慢，主要靠球茎繁殖，其球茎休眠期可长达6个月，无法满足人类对其有效成分的临床需求。内生真菌可存在于不同的植物中，与宿主植物长期协同进化，在此漫长的共同进化过程中，彼此形成平衡稳定的互利共生和特殊的寄生关系[8]。许多内生真菌不仅从宿主植物中吸取营养物质满足自身生长发育需要，而且可提高宿主植物对环境胁迫的抗性，如抗病虫害、抗干旱等抗性;同时，也可产生具有生物活性的次生代谢产物，为开发新药和新的化合物提供重要依据。

本研究从青天葵的块茎、茎和叶中分离得到23株内生真菌，不同组织内生真菌分布不同，以茎中的内生真菌数量最多，而块茎中分离得到的内生真菌数量最少，原因可能是地上部分和地下部分环境差异较大。这23株菌株鉴定属于同一个属，可以看出，青天葵内生真菌资源单一，与其他植物存在差异[18]，需要从不同采样点采用不同分离方式进行再次分离鉴定方能验证。对这23株内生真菌进行抑菌活性的筛选，获得1株抑菌活性较强的菌株MQY-1（C. truncatum），该菌株对多种病原真菌有一定的抑制作用，具有一定的应用价值，其具有生物活性的次生代谢产物、发酵工艺的优化以及其对植物生长的影响等方面还有待进一步深入研究。

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