UV-B对红豆杉不同提取方式紫杉醇含量的影响

郝婧玮 梅念念 渠利霞 黄静 季宇彬

摘要：以东北红豆杉的枝和叶为原材料，在UV-B紫外辐射的条件下，分别采用超声提取法、酶解法、微波法来研究紫杉醇的提取工艺，定时取样。对3种方法提取的紫杉醇样品通过高效液相色谱法（HPLC）进行含量检测，研究UV-B对不同提取方式下紫杉醇含量的影响。测定结果显示，紫杉醇标准品在5.7～6.1 min出峰，计算峰面积，进而求得紫杉醇提取率，来判断UV-B对这3种提取方法的影响。结果表明，在UV-B条件下，1～2 h内，紫杉醇含量增加，在紫外辐射2 h时，提取率达到最大值;在3～5 h内，紫杉醇含量逐渐下降。在3种方法中，超声提取法优于酶解法，酶解法优于微波法，微波法的提取效果稍差，超声提取法在紫外辐射2 h时，提取率达到最大值，为7.65%。其中2种方法合用优于单一法，加入纤维素酶的微波法在紫外辐射2.5 h时，提取率为8.39%。

关键词：紫杉醇;高效液相色谱（HPLC）;UV-B紫外辐射;红豆杉;提取方式

中图分类号： S791.490.1;R284.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）21-0266-04

收稿日期：2018-08-09

基金项目：牡丹江师范学院科研项目（编号：QY2014010）;黑龙江省教育厅项目（编号：1353MSYQN009）;哈尔滨商业大学研究生创新科研专项基金（编号：YJSCX2017-402HSD）。

作者简介：郝婧玮（1985—），女，辽宁宽甸人，硕士，讲师，主要从事肿瘤药理学研究。Tel：（0453）6511042;E-mail：swxhjw@126.com。

红豆杉（Taxus chinensis）是红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus）植物的总称，别名紫杉。因资源稀少，红豆杉被划分在我国一级珍稀保护树种范围内[1]。我国红豆杉有1个变种4个种，分散于我国大部分地区[2]。从红豆杉树皮和枝叶中提取的紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）的药用价值很高，是一种治疗癌症的一线临床用药[3]。

东北红豆杉作为珍稀藥用植物[1-4]，主要分布在中国东北地区、日本、朝鲜、俄罗斯等，主要以茎、枝、叶、根入药，有抗肿瘤作用，并可以抑制糖尿病和心脏病[5-6]。从东北红豆杉枝叶中分离得到了紫杉烷类二萜化合物、倍半萜类化合物、甾体类化合物、木脂素类化合物、黄酮类化合物、糖苷类化合物及其他类化合物等多种成分，多种化合物是通过植物次生代谢途径生成的，其中最具代表性的物质是紫杉醇和三尖杉宁碱。紫杉醇是从红豆杉属植物中分离得到的一种具有五甲基十五碳烯骨架的二萜类化合物，具有独特的抗癌作用，能与微管蛋白结合，并促进其聚合、抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细胞的增殖，对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等十几种癌症具有很好的疗效[7-8]，同时对治疗恶性黑色素瘤、类风湿性关节炎和早老性痴呆[9-11]等也有一定潜力。由于其作用机制新颖、疗效独特、广谱抗癌的特点，紫杉醇成为世界关注的焦点[12-14]。紫杉醇的开发、研究和应用已成为近年来肿瘤化疗研究中的热点之一。然而，植物中紫杉醇的含量极低，天然资源匮乏、含量低、全合成成本高一直制约着紫杉醇的临床应用[15-16]，从1 kg干树皮中仅能分离得到50～150 mg紫杉醇，1 g紫杉醇需要3～4株60龄的树来生产。为满足临床用药的需求，寻找新的生物资源已迫在眉睫。本研究以东北红豆杉枝叶为试验材料，对其紫杉醇进行了初步研究，并建立了应用高效液相色谱法测定东北红豆杉枝和叶中紫杉醇含量的方法[9-11]，对不同方法提取红豆杉中紫杉醇最佳工艺进行研究，为东北红豆杉这种可再生资源的开发、利用及质量标准研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料预处理

剪取东北红豆杉植物体部分枝叶，放入恒温箱中烘24 h，烘干至恒质量。将枝叶放入微型植物粉碎机中粉碎，称取，分装。称取1.5 g红豆杉粉末分别装在①②③④号锥形瓶中，按料液比1 g ∶10 mL用甲醇对红豆杉粉末进行浸提;将4个锥形瓶于紫外灯下照射5 h，并且隔1 h取样，备用。

1.2试验方法

1.2.1酶解法提取依据10 ∶1的红豆杉粉末、纤维素酶的质量比例，在①号样品瓶中加入0.15 g纤维素酶。60 min后，将①号样品瓶再放于紫外灯下照射5 h，每1 h取样，得到样品，备用。

1.2.2超声提取法提取将②号样品瓶放入超声波清洗机中超声60 min。然后，将①号样品瓶再放于紫外灯下照射5 h，每1 h取样，得到样品，备用。

1.2.3微波法提取依据10 ∶1的红豆杉粉末、纤维素酶的质量比例，在④号样品瓶加入0.15 g纤维素酶，与③号样品瓶一同放入微波炉中大火微波4～5 s。将③号和④号锥形瓶样品再放于紫外灯下照射5 h，每1 h取样，得到样品，备用。

1.2.4高效液相色谱检测条件的建立色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-乙腈-水（体积比为34 ∶32 ∶34）为流动相，检测波长为227 nm[17]。将样品离心6～8 min，12 000 r/min。取有关物质项下系统适用性溶液10 μL 注入液相色谱仪[18-19]，对标准品、抽样的样品进行液相色谱分析，将样品紫杉醇峰与紫杉醇标准品进行对照，观察出峰时间。得到数据，谱图，进行分析。

1.2.5标准曲线的建立精确称取4 mg紫杉醇标准品，用2 mL 甲醇配制成浓度为2 mg/mL的标准品溶液，取1 mL标准品溶液进行稀释，在此溶液中再取1 mL进行稀释，以此类推，梯度浓度不断稀释，配制出2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL 一系列浓度的溶液，得到标准品溶液[19]。按高效液相色谱（HPLC）条件进行检测，求峰面积。绘制标准曲线，计算回归方程。

2结果与分析

2.1标准曲线回归方程

线性回归方程为y=6×106x+20 357，相关系数为r2=1。其中y为峰面积，x为标准品质量浓度（图1、图2）。

2.2UV-B对酶解法提取紫杉醇含量的影响

通过图3、图4可以看出，紫外照射前5 h内，原材料经预处理后进行浸提过程紫外照射1～2 h，紫杉醇含量增加，紫外照射3～5 h，紫杉醇含量下降。在酶解法中，加入纤维素酶后进行提取，由于酶分解细胞壁的作用促进紫杉醇含量增加，在紫外照射1～2 h内，紫杉醇含量增加;在紫外照射3～5 h内，紫杉醇含量逐渐下降。

2.3UV-B对超声波法提取紫杉醇含量的影响

通过图5、图6可以看出，在超声提取法中，由于振荡破碎作用，紫杉醇含量增加，在紫外照射1～2 h内，紫杉醇含量增加;在紫外照射3～5 h内，紫杉醇含量逐渐下降。

2.4UV-B对微波法提取紫杉醇含量的影响

通过图7、图8、图9可以看出 在微波法中，由于微波加热作用，紫杉醇含量增加，紫外照射2.5 h内，紫杉醇含量缓慢增加，紫外照射5 h时，紫杉醇含量下降。加有纤维素酶的微波法，由于双重作用，紫杉醇含量增加明显，照射2.5 h时，含量比照射0 h时明显增加了2倍以上，照射5 h时，含量有所下降。

3讨论

本研究主要分析UV-B对不同提取方法紫杉醇含量的影响。在UV-B相同的条件下，观察UV-B对不同提取方法紫杉醇含量的影响。通过紫杉醇提取率的比较，结果表明，UV-B对酶解法、超声提取法、微波法这3种不同提取方法提取的紫杉醇含量有不同的影响，但影响趋势是相似的，均为在UV-B条件下1～2 h呈增长趋势，3～5 h呈现下降趋势。这可能是由于紫外辐射的增强可诱导植物产生较多酚醛类等紫外吸收物质，增强抗氧化能力，减少紫外辐射对植物自身的伤害。有研究表明，二萜类化合物合成的关键酶乙酰辅酶A（acetyl-CoA）与乙酰乙酰辅酶A（acetoacetyl-CoA）受紫外和蓝光调控，在紫外辐射下二萜类合成途径的乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A以及其他分支点的酶积累或活性加强，引起植物体内萜类及二萜类化合物等的增加。作为二萜类化合物的紫杉醇与三尖杉宁碱是红豆杉光合作用过程中通过一系列酶促反应得到的，其代谢受到许多代谢酶的调控。在紫外胁迫的环境下，东北红豆杉鲜叶中二萜类化合物表现出含量变化的现象，其实质是紫外辐射影响了萜类化合物代谢过程中的许多关键酶和调节萜类代谢的一些重要反应。在本试验中，由于不同方法本身对红豆杉植物的作用不同，所以紫杉醇含量的增加或下降的幅度不同。

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