盐度驯化对虹鳟鳃、肌肉和肝脏非极性脂脂肪酸的影响❋

刘文娟， 董 亢， 刘骋跃， 董双林,2 ❋❋， 周演根,2

(1.海水养殖教育部重点实验(中国海洋大学)，山东 青岛 266003; 2.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266235)

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)具有肉质细嫩，肥厚刺少，味道鲜美，EPA、DHA等PUFA含量高的特点，是水产养殖的名贵肉食性鱼类之一[1-2]。自20世纪引进虹鳟以来，我国虹鳟养殖多以水库或淡水池塘养殖为主[3-7]，对于不同品系虹鳟体内脂肪酸含量和不同养殖水体虹鳟的生长、免疫、一般营养成分的比较研究有见报道[1-2, 8-11]。

近些年，鲑鳟鱼类海水工厂化养殖开始兴起[8]，我国科技工作者也已开始在开放的黄海冷水团海域养殖包括大西洋鲑(Salmosalar)、洄游型硬头鳟(Oncorhynchusmykiss)和虹鳟等鲑鳟鱼类。有研究表明，与淡水养殖虹鳟相比，经盐度驯化后海水养殖虹鳟的生长状况、免疫力和肌肉品质均有提高[9-11]。

鲑鳟鱼类多是海淡水洄游鱼类，淡水中培育的鱼种在进入海水养殖之前需要盐度驯化。鱼类主要通过渗透压调节来适应不同盐度的水体环境，此过程需要消耗大量能量。脂质作为三大能源物质之一，在鱼体供能方面发挥着重要的作用[12]。脂质可以分为极性脂和非极性脂，而非极性脂被认为是鱼类能量的重要储存形式[13]。非极性脂主要由三酰基甘油组成，此外还包括少量的二酰甘油和酰基甘油[14]，多存在于鱼类的肌肉、肝脏和肠系膜中，其提供的能量是等重量糖原的5倍[15]。除了提供能量，鱼体内非极性脂的含量和脂肪酸组成也会影响鱼的风味和营养，一般认为鱼肉的脂肪含量越高，带给人的香郁、细腻之感越强[16]。

研究表明，水体盐度变化会影响鱼体内脂质的脂肪酸组成和含量[17]。高渗条件下，金头鲷 (Sparusauratus) 体内甘油三酯含量升高[18]；水体盐度升高能够改变金头鲷和红点鲑 (Salvelinusalpinus) 体内非必需脂肪酸 (NEFA) 含量[18-20]，提高虹鳟[21]和花鲈(Lateolabraxmaculatus)[22]肌肉中EPA和DHA的含量。郭振[23]等对不同盐度水体的罗非鱼(Oreochromisniloticus)脂肪酸研究发现，水体盐度升高可以提高实验罗非鱼肌肉中的饱和脂肪酸 (SFA)、单不饱和脂肪酸 (MUFA) 和多不饱和脂肪酸 (PUFA) 含量，提高PUFA/SFA比值，增加罗非鱼脂肪酸的营养价值。

鲑鳟鱼类的鳃、肌肉和肝脏在渗透压调节和能量供给方面起着十分重要的作用，而此3种组织器官的脂肪酸与渗透压调节和能量供给密切相关。目前，对于虹鳟体内脂肪酸的研究多集中在种类和含量上，而关于海水驯化对虹鳟不同组织脂肪酸的影响鲜有报道[24]。本实验通过测定盐度驯化前后虹鳟鳃、肌肉和肝脏中非极性脂脂肪酸的组成与含量，发现盐度驯化引起的虹鳟3种组织器官内非极性脂脂肪酸的变化，探究虹鳟鳃、肌肉和肝脏3种组织器官在盐度驯化过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验方法

本实验于2017年7月2日～8月9日在中国海洋大学鱼山校区进行，实验材料为三倍体虹鳟，取自山东省日照市万泽丰渔业有限公司鲑鳟鱼繁育场。

实验虹鳟先在实验室暂养2周(温度(16±0.5) ℃，盐度0)。之后选取60尾生长状况良好，规格相近((195.23±15.75) g)的虹鳟，随机分到3个圆形玻璃纤维水缸(277 L；高58 cm；半径39 cm)中。实验开始后，以每天增加2个盐度的速度，将盐度从0升到30。实验期间，每天08:00和18:00投喂2次，投喂量为实验鱼总体重的2%。投喂2 h后吸残饵粪便、换水，每次换水量为总体积的1/2。水温控制在(16±0.5) ℃(使用温控系统，ZKH-WK 2000，中科海水质处理有限公司)；气石充气，水体溶氧含量6 mg/L以上；光照周期为12 h光照∶12 h黑暗；使用YSI专业水质检测仪(Yellow Spring, Ohio, USA)，监测记录水缸内的水温、溶解氧、酸碱度和盐度等水质数据。实验虹鳟投喂商品饲料，饲料脂肪酸组成如表1所示。

本实验过程中水体水质状态良好，实验虹鳟未出现受伤、死亡现象。分别对盐度变化前(0)和海水(30)适应一周后的虹鳟进行取样。取样前一天停止投喂，每缸随机选取3尾鱼。使用麻醉剂MS-222(浓度70 mg/L)将鱼麻醉，取其鳃丝、背肌(胸鳍至臀鳍之间，侧线以上的背部肌肉)和肝脏组织到冻存管，迅速放到液氮中，然后转移到-80 ℃冰箱中待测。

1.2 非极性脂脂肪酸的提取和测定

1.2.1 非极性脂的提取 样品非极性脂的提取基本参考刘骋跃的方法[24]。取组织样品0.1 g，加入3.3 mL甲醇溶液，匀浆机匀浆1 min，加入6.6 mL氯仿溶液，倒入10 mL甲酯化试管中，摇床震荡30 min(37 ℃, 130 r/min)，漏斗过滤到新的甲酯化试管，用氯仿/甲醇(2∶1, v/v)混合液定容至10 mL，4 ℃下静置过夜。取氯仿层，氮气吹干，用石油醚复溶至10 mL，-20 ℃条件保存。取2 mL油脂和石油醚混合液到4 mL EP管中，氮气吹干，加入20 μL石油醚，用毛细管吸取，均匀地点在硅胶板(10 cm× 5 cm)上，在极性展开剂(氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4)中展开，用单质碘显色后将极性脂刮下放入甲酯化试管中，加入2 mL甲酯化试剂(HCl-甲醇溶液)，充入氮气，水浴锅中90 ℃水浴3 h，加入1 mL色谱级正己烷，振荡均匀后静置，分层后取上层正己烷溶液(含脂肪酸甲酯)，氮气吹干，用色谱级正己烷复溶至50 μL，放入气相色谱进样瓶中待测。

表1 饵料中脂肪酸的组成Table 1 Fatty acid composition of the diet /%

1.2.2 脂肪酸的测定 脂肪酸甲酯的检测使用气相色谱仪(日本岛津，GC-2010 plus)，进样量1 μL，检测器为火焰电离化检测器(日本岛津，GC-2010)，气相色谱柱为RTX-WAX石英毛细管柱(柱长30 m，内径0.25 mm ，膜厚0.25 μm，美国，Phenomenex)。升温程序：60 ℃维持1.0 min，以10 ℃/min的升温速度升到190 ℃，然后以2.0 ℃/min的升温速度升到260 ℃，维持0.6 min。色谱峰的定性以与37种脂肪酸甲酯混合标品(美国，Supelco)的保留时间相比较的方式进行，定量采用面积归一法(外标法，5点定标)。

不饱和指数(UI)、不饱和率(U/S)的计算方法如下(Snyder & Hennessey[24-25]; Williams Hazel[24-26])：

UI=∑(% 单烯脂肪酸 + 2 × % 双烯脂肪酸+3×%三烯脂肪酸 …)/100；

U/S = ∑(% UFA)/ ∑(% SFA)。

式中% 表示其所占百分比。

1.3 数据统计分析

实验数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用SAS 9.4(SAS Institute Incorporated, Cary, North Carolina, USA)进行统计分析，使用t检验对盐度驯化前后不同器官的非极性脂脂肪酸组成进行差异性检测，P<0.05表示显著差异。

2 实验结果

实验结果(见表2)表明，盐度驯化前后，虹鳟鳃、肌肉和肝脏组织非极性脂脂肪酸的种类组成相同。鳃中检测出15中脂肪酸，包括4种饱和脂肪酸(SFA)，4种单一不饱和脂肪酸(MUFA)，8种多不饱和脂肪酸(PUFA)。肌肉和肝脏中均检测出19种脂肪酸，包括6种SFA，5种MUFA，8种PUFA。3种器官的非极性脂中，SFA所占比例最高的是棕榈酸(16:0)，其次是硬脂酸(18:0)；MUFA所占比例最高的是油酸(18:1n9)；PUFA所占比例最高的是DHA(22:6n3)，其次是亚油酸(18:2n6)，α-亚麻酸(18:3n3)的占比也相对较高，然而，EPA(20:5n3)和ARA(20:4n6)的占比并不是很高。

盐度驯化之后，虹鳟鳃的非极性脂脂肪酸组成变化不显著(见表2)。与淡水组相比，升盐组虹鳟鳃的非极性脂中SFA和MUFA比例略有升高，PUFA比例略微下降，但均不显著。

但盐度驯化后，虹鳟肌肉的非极性脂脂肪酸变化明显。相比于淡水组，升盐组虹鳟肌肉的非极性脂中SFA比例显著下降(P<0.05)，MUFA比例下降，但不显著，PUFA比例显著上升(P<0.05)。PUFA中的长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，如22:6n3，20:5n3和20:4n6变化不明显，但18:2n6和18:3n3比例显著升高(P<0.05)，亚麻酸族不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)和亚油酸族不饱和脂肪酸(n-6 PUFA)比例也明显升高(P<0.05)，从而导致不饱和指数(UI)和不饱和率(U/S)的显著上升(UI,P<0.05; U/S,P<0.05)。

对于肝脏，盐度驯化前后虹鳟肝脏的非极性脂脂肪酸变化与肌肉相似。海水组虹鳟肝脏的非极性脂中SFA比例显著下降(P<0.0.05)，其中的棕榈酸(16:0)下降明显(P<0.05)；MUFA比例略有下降，但不显著，18:2n6和18:3n3的比例显著上升(P<0.05)，n-3 PUFA和n-6 PUFA的比例也明显上升(P<0.05)，从而使得PUFA的比例、UI和U/S明显升高(P<0.05)。

3 讨论

当外界水体盐度发生变化时，鱼类通过调节体内渗透压来维持内环境的稳定，该调节过程消耗大量能量[17]。脂质，特别是非极性脂，作为鱼类的主要储能物质[27]，是鱼类重要的能量供应来源[13,15,17]。

盐度驯化前后，本实验虹鳟鳃组织的非极性脂脂肪酸组成未发生显著变化(P>0.1)，表明虹鳟的鳃并不是主要的能量供应器官。有人研究发现，鳃是鱼类主要的渗透压调节器官，其通过Na+/K+-ATPase酶实现对离子进出的控制，Na+/K+-ATPase酶的活性易受到鳃的磷脂脂肪酸的影响，而鳃的非极性脂对Na+/K+-ATPase酶的活性影响不大[28-30]。如Bystriansky等[31]研究发现红点鲑鳃中Na+/K+-ATP酶的活性随ARA(20:4n6)和DHA(22:6n3)含量的增加而升高。刘骋跃等[24]研究发现，虹鳟在海水驯化之后鳃组织的磷脂脂肪酸中SPA比例上升，PUFA富集。鱼鳃的非极性脂脂肪酸的组成会受到饲料成分的影响，但对周围环境因子的变化较不敏感[32-33]，如Hansen和Abraham[34]研究发现，盐度的变化和饥饿胁迫均未影响欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)鳃中非极性脂脂肪酸的组成。由于鱼鳃组织的特殊结构，鳃丝细胞中用于贮存能量的非极性脂含量较少[35]。本实验中，淡水组和升盐组虹鳟鳃的非极性脂脂肪酸组成为均为15种，少于肌肉和肝脏的19种，且每种脂肪酸的占比没有显著差异，这可能是鳃本身非极性脂含量低，鳃的主要功能是吸收和排泄离子，而不是供应能量。

与鳃组织不同，本实验虹鳟的肌肉和肝脏中，非极性脂脂肪酸组成在经历盐度驯化后，SFA占比显著下降(P<0.05)，PUFA显著上升(P<0.05)，使得肌肉和肝脏非极性脂的UI和U/S显著升高(P<0.05)。这可能是实验虹鳟为适应高盐水体环境，优先分解利用以16:0为主的SPA调节渗透压，以维持内环境稳定。曾霖[6]等也发现增加水体盐度可提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼鱼肌肉中的PUFAs和EPA+DHA等含量，同时降低SFA总量。花鲈(Lateolabraxjaponicus)[36]、大西洋鲑(Salmosalar)[37]、遮目鱼(Chanoschanos)[38]等也表现出类似现象。Hagen等[32]研究发现，鱼类主要利用体内不同组织脂肪中的SFA和MUFA供能，从而节约了机体蛋白质与脂肪中的PUFA，以维持重要的生命活动。Mellery等[39]发现，鱼体内脂肪酸的代谢顺序一般是：SPA>MUFA>PUFA>LC-PUFA、n-6 PUFA> n-3 PUFA。此外，鱼类在适应海水过程中，机体内分泌多种激素，如生长激素、血管紧张激素、皮质类固醇等，也会间接影响多不饱和脂肪酸的生物合成。Zheng等[40]发现，大西洋鲑入海时，肌肉内Δ 6去饱和酶的表达显著升高，从而使其在入海后PUFA含量大幅升高。Sheridan等[41]的研究也发现，淡水生活的硬头鳟体内PUFA的含量显著低于海水生活的硬头鳟，并且Δ 5去饱和酶的活性显著上升。Bell等发现，大西洋鲑幼鱼在向海水过渡和渗透压调节过程中会调控食物选择，以增加体组织中的ARA及其产生的类花生酸类物质[42]。ARA和类花生酸类物质在鲑鳟鱼幼鱼的银化入海过程中发挥重要作用[43]。

表2 盐度驯化前(淡水组FW)后(升盐组SW)虹鳟鳃、肌肉、肝脏非极性脂脂肪酸组成Table 2 Fatty acid compositions of non-polar lipid in the gill, muscle and liver of rainbow trout before (freshwater FW) and after (seawater SW) acclimation /%

注：数值以平均值±标准差表示，同行中带有“*”表示具有显著差异(P<0.05)。FW：淡水处理组；SW：升盐处理组；SFA：饱和脂肪酸；MUFA：单一不饱和脂肪酸；PUFA：多不饱和脂肪酸；n-3 PUFA：亚麻酸族不饱和脂肪酸；n-6 PUFA：亚油酸族不饱和脂肪酸；UI：不饱和指数；U/S：不饱和率。

Note: Values are mean ± SD, Significant differences (P<0.05) each row are indicated by superscript “*”. FW: Freshwater treatment; SW: Seawater treatment; SFA: Saturated fatty acid; MUFA: Monounsaturated fatty acids; PUFA: Polyunsaturated fatty acid; n-3 PUFA: Omega-3 series polyunsaturated fatty acid; n-6 PUFA: Omega-6 series polyunsaturated fatty acid; UI: Unsaturated index; U/S: The ratio of unsaturated and saturated fatty acid.

本实验中，盐度驯化后，虹鳟肌肉和肝脏的非极性脂中EPA、DHA和ARA占比略有升高，但不显著(P>0.1)；而18:2n6和18:3n3等C18 PUFA的比例显著上升(P<0.05)。先前研究表明，鱼体内的内源性LC-PUFA通常由其C18 PUFA前体经去饱和作用和碳链延长作用合成[44]，并且C18 PUFA可作为脂代谢关键转录因子的配体，参与激活LC-PUFA关键基因的表达[45]。盐度驯化后，虹鳟肌肉和肝脏非极性脂中18:2n6和18:3n3的增加，可能会提高它们转化为EPA和DHA的速率，有助于虹鳟体内LC-PUFA的生物合成，利于虹鳟的生长发育。

4 结语

盐度驯化前后，虹鳟鳃、肌肉和肝脏中的非极性脂脂肪酸会产生组织特异性变化。经历盐度驯化，虹鳟鳃中非极性脂脂肪酸变化不显著，因此，鳃不是渗透调节的主要能量供应器官。肌肉和肝脏的非极性脂中大量SPA被分解代谢，为虹鳟调节渗透压，维持内环境稳定提供能量。与淡水虹鳟相比，经盐度驯化的虹鳟肌肉和肝脏中的n-3 PUFA和n-6 PUFA比例显著上升，C18 PUFA作为LC-PUFA的合成前体，其比例的上升可能会加快肌肉和肝脏中EPA、DHA和ARA等的生物合成，有利于虹鳟对海水环境的适应。