猪传染性胸膜肺炎黄芪多糖灭活疫苗免疫效果的研究

胡迎东

（江西宜春学院，江西 宜春 336000）

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP） 是由胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacillus pleuropneu-moniae，APP)引起猪的一种以胸膜炎和肺炎为主要特征的高度传染性呼吸道传染病[1]。APP对猪具有高度宿主特异性，病原可通过飞沫扩散传播，各阶段猪均对其易感，尤其是断奶仔猪在环境条件温度、湿度应激下多发，造成饲料的报酬降低和药物的防制费用增加，给养猪场造成重大的经济损失。近些年来呈不断上升趋势，APP现已发现有15个血清型，而在不同地区流行的血清型可能有所差异，主要以 1、3、7型为主[2-4]，从而降低了现有多价疫苗的免疫效果，给该病的防控带来了巨大困难。

黄芪多糖(Astragaluspolysaccharin，APS)是中药黄芪的主要生物活性成分，具有提高T淋巴细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞等免疫细胞的数量和功能，增强巨噬细胞活性，增强机体的免疫功能，诱导干扰素产生等作用[5-7］；近年来，很多研究证实黄芪多糖能明显增强机体的非特异性免疫和特异性免疫，显著提高机体的抗病力和抵抗力水平，可作为多种疫苗的免疫增强剂，提高疫苗的免疫效果[8-10］；同时APS作为天然药物成分，具有对动物机体毒副作用小、无残留等优点，对于绿色畜牧业的发展具有重要意义。

本试验通过对江西某地区分离鉴定的胸膜肺炎放线杆菌进行分离培养后，用甲醛进行灭活，加入黄芪多糖佐剂，制成黄芪多糖灭活苗；然后对疫苗的物理性状、安全性、有效性等进行实验研究，探讨黄芪多糖对猪胸膜肺炎放线杆菌灭活苗的免疫增强效果，探索黄芪多糖作为一种胸膜肺炎放线杆菌疫苗佐剂的可行性，为黄芪多糖在胸膜肺炎放线杆菌疫苗免疫中的推广应用提供理论支持。

1 材料

黄芪多糖购自山河南聚丰饲料科技有限公司；6周龄仔猪来当地APP阴性养猪场，经IHA检测,APP血清抗体效价均小于1∶4。猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV ELISA抗体检测试剂盒，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司。

2 方法

2.1 菌的扩增

将分离鉴定的胸膜肺炎放线杆菌种子液1%接种于TSB液体培养基，37℃条件CO2培养箱培养24h，进行细菌计数，分别接种于普通琼脂、厌氧肉肝汤、马丁肉汤37℃恒温箱培养48 h，检测其有无杂菌生长。

2.2 猪胸膜肺炎黄芪多糖佐剂灭活疫苗的制备

2.2.1 灭活条件的选择。TSB液体培养基24 h胸膜肺炎放线杆菌培养物，用PBS液（pH7.4）稀释至含菌浓度为4×109CPU/mL，然后分别加入终浓度为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的甲醛，摇晃均匀，37℃每隔2h将其摇匀一下，使其充分灭活24 h。然后用灭菌接种环在每个灭活浓度的中蘸取少量菌液，TSA培养基上划线,37℃条件CO2培养箱培养48 h，看有无细菌生长。

2.2.2 无菌实验 。取含菌浓度为4×109CPU/mL的胸膜肺炎放线杆菌菌液，加入上述试验甲醛的最佳灭菌浓度搅拌均匀，37℃每隔2 h将其摇匀一次，灭活24 h。灭活后取样分别接种于TSA培养基37℃条件CO2培养箱培养48 h，普通琼脂、厌氧肉肝汤、马丁肉汤37℃恒温箱培养48 h，观察是否有细菌生长。

2.2.3 黄芪多糖佐剂灭活疫苗的制备。在保持疫苗抗原剂量为1 mL、2 mL、3 mL的条件下，将灭活完全的猪胸膜肺炎放线杆菌菌液与黄芪多糖混合,分别制成黄芪多糖终浓度1 000 mg/L、500 mg/L和250 mg/L的高、中、低黄芪多糖佐剂灭活疫苗，用胶体磨高速混匀。

2.2.4 疫苗使用剂量的测定。浓度为0.4%的甲醛进行灭活处理后，并将该疫苗1 mL/只的免疫量定为1个单位抗原剂量；6周龄的健康仔猪分为4大组，1A、1B、1C、2A、2B、2C、3A、3B、3C及第 4 组，均为 2头，共20头。

1A组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗1mL，其中含有黄芪多糖终浓度250 mg/L，1B组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗1 mL，其中含有黄芪多糖终浓度500 mg/L，1C组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗1mL，其中含有黄芪多糖终浓度为1 000 mg/L；

2A组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗2 mL，其中含有黄芪多糖终浓度250 mg/L，2B组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗2 mL，其中含有黄芪多糖终浓度500 mg/L，2C组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗2 mL，其中含有黄芪多糖终浓度为1 000 mg/L；

3A组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗3 mL，其中含有黄芪多糖终浓度250 mg/L，3B组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗3 mL，其中含有黄芪多糖终浓度500 mg/L，3C组于耳后肌肉分别注射所制备的疫苗3 mL，其中含有黄芪多糖终浓度为1 000 mg/L；

第4组作为对照组，首次免疫之后3周再分别对第1、2、3 组加强免疫 1 mL、2 mL、3 mL一次，2 周后分别对4组实验猪只攻毒，攻毒剂量为1×107CPU/只。攻毒后每日观察各组猪只的体温、健康状况及发病死亡情况。

2.3 疫苗的安全性检测

选取8头6周龄的健康仔猪，分为4组，第1组为常规免疫剂量组，第2组为超剂量免疫组，第3组为对照组，对第1组的仔猪颈部肌肉注射2 mL疫苗，超剂量组免疫接种注射10 mL疫苗，对照组不接种，观察1周，每日测定体温，注射部位有无炎症，并观察是否有针对免疫的副反应及仔猪的健康状况。

2.4 疫苗对健康仔猪的免疫保护力实验

2.4.1 选取15头6周龄的健康仔猪，分为实验组10头，另设对照组5头。以黄芪多糖灭活疫苗使用剂量为2 mL/只（其中黄芪多糖含量为500 mg/L）对10头仔猪进行初次免疫，3周后进行二次免疫，免疫剂量方法同初免，在二免之后 14d、21d、30d、60d、90 d分别选取2头免疫组猪只采取少量血清进行猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA抗体测定。

2.4.2 在进行猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA抗体测定后对采血后动物进行攻毒试验，方式是以鼻腔接种的方式对免疫组接种猪胸膜肺炎放线杆菌强毒，攻毒剂量为1×107CPU/只；攻毒免疫组的同时，选取对照组一头猪只进行攻毒试验，每日测量其体温、观察记录其健康状况。对濒死或病症严重的猪只进行剖检，观察病理变化，采集典型病料于-20℃保存。

3 结果

3.1 菌的扩增

将分离鉴定的胸膜肺炎放线杆菌种子液1%接种于TSB液体培养基，37℃摇床振荡培养24 h，进行细菌计数，检测结果为无杂菌生长。

3.2 猪胸膜肺炎黄芪多糖佐剂灭活疫苗的制备

3.2.1 灭活条件的选择。取TSB液体培养基24 h猪胸膜肺炎放线杆菌培养物，用PBS液（pH7.4）稀释至含菌浓度为4×109CPU/mL，然后分别加入终浓度为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的甲醛，摇晃均匀，37℃每隔2 h将其摇匀一下，使其充分灭活24 h。然后用灭菌接种环在每个灭活浓度的中蘸取少量菌液，TSA培养基上划线，37℃恒温箱培养 48 h，0.2%、0.3%浓度的甲醛灭活时有少量细菌生长，而0.4%、0.5%浓度的甲醛灭活时无细菌生长，所以猪胸膜肺炎放线杆菌最佳灭活条件为甲醛浓度为0.4%、37℃灭活 24 h。

3.2.2 黄芪多糖灭活疫苗的无菌实验。取含菌浓度为4×109CPU/mL的猪胸膜肺炎放线杆菌菌液，加入上述试验甲醛的最佳灭菌浓度搅拌均匀，37℃每隔2 h将其摇匀一次，灭活24 h。灭活后取样分别接种于TSA培养基37℃条件CO2培养箱培养48 h、普通琼脂、厌氧肉肝汤、马丁肉汤37℃恒温箱培养48h，无细菌及霉菌等微生物生长。说明该黄芪多糖灭活疫苗纯粹无杂菌。

3.2.3 疫苗使用剂量的测定。待前3大组二免后2周，以1×107CPU/只的剂量对所有4组进行攻毒实验，攻毒后每日观察各组猪只的体温、健康状况及发病死亡情况，结果如下（见表1）：第1组猪均出现食欲下降、间断性咳嗽的症状，第2A组出现间断性咳嗽症状、2B、2C组及第3组无症状，第4组病猪发热、咳嗽，全部死亡。所以黄芪多糖灭活疫苗的使用剂量为2 mL/只，黄芪多糖剂量含量为500 mg/L。

表1 疫苗接种剂量测量结果

3.3 黄芪多糖灭活疫苗的安全性检测

从表2中可以看出，常规免疫剂量（2 mL）组、超剂量免疫组（10 mL）及对照组均体温、食欲等均正常，未出现呼吸困难、行动缓慢等症状，说明黄芪多糖灭活疫苗没有不良反应，安全性好。

3.4 疫苗对健康仔猪的保护力实验

表2 黄芪多糖灭活疫苗的安全性检测结果

3.4.1 在二免之后 14 d、21 d、30 d、60 d、90 d 分别选取2头免疫组猪只采取少量血清进行猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA抗体测定。在450 nm处测量记录样品和对照的吸光度值，计算抗体阻断率(S/P)，公式为S/P=(样品OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100%，并计算抗体平均阻断率。检测结果的判定标准为:S/P＜0.3为阴性，S/P≥0.4为阳性，0.3≤S/P＜0.4为可疑;结果如下表3：

由表3中数据可以看出，二免后仔猪传染性胸膜肺炎的抗体平均阻断率逐渐升高，在二免后第30天达到高峰，随后抗体平均阻断率逐渐下降，但仍维持在较高水平。

表3 不同日龄试验仔猪二免后猪胸膜肺炎放线杆菌抗体平均阻断率

3.4.2 以2 mL黄芪多糖灭活疫苗免疫剂量对10头仔猪进行免疫,攻毒实验时间为加强免疫后14d、21d、30 d、60 d、90 d，另设对照组 5 头。表 4 结果显示:二免后 14 d、21 d、30 d、60 d 免疫实验组未发病，90 d 组有一只发病，发病率10%，疫苗保护率总体为90%；而对照组均表现出发热、咳嗽等症状。

表4 疫苗对仔猪的保护率实验结果

4 小结

4.1 对制苗菌株生产的抗原灭活后进行了灭活检验,实验最终确定甲醛的灭活抗原条件为甲醛浓度为0.4%、37℃灭活 24 h。

4.2 在灭活完全的基础上，最终确定在疫苗使用剂量为2 mL/只，其中黄芪多糖含量为500 mg/L时能显著提高动物保护能力。

4.3 对疫苗进行的大剂量安全性试验表明,用2 mL/只的疫苗免疫剂量免疫猪群无不良反应，安全可靠，无毒副作用，安全性好。

4.4 对二免之后 14 d、21 d、30 d、60 d、90 d 的猪只进行猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA抗体测定，表明二免后仔猪传染性胸膜肺炎的抗体平均阻断率逐渐升高，在二免后第30天达到高峰，随后抗体平均阻断率逐渐下降，但仍维持在较高水平；攻毒试验结果表明二免后 14 d、21 d、30 d、60 d 免疫实验组未发病，90 d组有1头发病，发病率10%，疫苗保护率总体为90%；而对照组均表现出发热、咳嗽等症状，说明黄芪多糖猪传染性胸膜肺炎灭活苗具有较好的免疫保护性。

综上所述，黄芪多糖含量为500 mg/L时能显著提高仔猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗的免疫效果，使免疫猪群获得具有较好的免疫保护性，具有一定的应用前景。