氮素营养对铁皮石斛生长和生理的影响

史 俊， 杨鹤同， 徐 超， 席刚俊

(江苏农林职业技术学院，江苏镇江 212400)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科石斛属多年生草本植物，分布于安徽、浙江、福建、广西、四川及云南等地海拔800～1 500 m山地覆有苔藓或腐殖质的岩石或树干上[1]，其为富含多糖、生物碱、氨基酸及矿物质等多种有益于人体健康的药用活性成分，具有益胃生津、滋阴清热、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力等功效[1-4]，铁皮石斛在自然状态下自身繁殖困难，由于长期毁灭性采挖与生存环境破坏，造成野生资源濒临灭绝，现已将铁皮石斛列为国家二级保护濒危药用植物[5]，是国家重点保护的药用植物品种之一。通过人工手段繁殖和栽培铁皮石斛是满足市场需求的主要手段，同时也对保护野生铁皮石斛资源具有重要意义。

氮素是所有植物体生长发育时期不能缺少的营养元素，是组成植物体内氨基酸、蛋白质、遗传物质以及叶绿素和其他关键有机分子的基本组成成分之一，所有植物体的正常生长发育都需要氮素来维持，但是氮素的过量摄入也会对植物造成严重伤害[6]。张珂等通过研究水氮互作对菘蓝光合生理影响发现，在适宜的中氮水平下，菘蓝的光合作用最强，而低水平供氮会使菘蓝光合作用受到抑制[7]。Shu等研究发现，在低氮条件下，高羊茅叶片中叶绿素含量降低，而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 和过氧化物酶(peroxidase，POD)活力却显著增强[8]。氮素不仅会影响植物体内在的光合作用，而且还通过影响体内一些重要的酶类控制植物的生理生化代谢，进而对其生长发育和产量产生极大的影响[9]。铁皮石斛的生长离不开氮素营养，但氮素营养提供过多或过少都会对铁皮石斛生长及生理指标产生不良影响。目前，针对培养基中氮素营养对铁皮石斛组培苗生长及生理指标影响的研究鲜见报道。 本研究以铁皮石斛组培苗为材料，在培养基中添加不同浓度的氮素，分析氮素营养对铁皮石斛的生长及生理指标的影响，从而为完善铁皮石斛组培快繁技术及提高田间施肥管理水平提供参考依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

铁皮石斛果实于2015年11月采自浙江乐清，经浙江省医学科学院张治国研究员鉴定为铁皮石斛的果实，2015年12月在江苏农林职业技术学院组培中心将铁皮石斛种子消毒后，接种到培养基(N6+NAA 0.1 mg/L+马铃薯汁80 g/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L)上培养3个月，形成原球茎后转接到分化培养基(N6+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥80 g/L+琼脂 7 g/L+蔗糖30 g/L)上培养3个月获得试管苗，选择长势相近、株高 2～3 cm的试管苗作为供试材料。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 基本培养基为N6培养基，添加NAA 1.0 mg/L、琼脂7 g/L、蔗糖30 g/L，通过调整(NH4)2SO4和KNO3浓度设置5种不同的氮素水平，分别为低氮水平(0.01、0.2 mmol/L)、中氮水平(5、10 mmol/L)、高氮水平(35 mmol/L)TN(全氮)，分别标记为N1、N2、N3、N4、N5(CK)。将铁皮石斛组培苗接种培养基，每瓶接种18株，每个处理接种5瓶，3个重复，培养室培养50 d，培养条件为：(25±2) ℃，光照1 000 lx，12 h/d。

1.2.2 形态指标测定 分别随机取10株苗测量株高、根长，统计生根数，称取全株鲜质量、根鲜质量、全株干质量、根干质量等生长指标。

1.2.3 生理指标测定 分别随机选取10株苗，剪取叶片，去除粗大的主叶脉，测定叶绿素、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)、游离脯氨酸(Pro)含量及SOD、POD活力，叶绿素、MDA含量测定分别采用80%丙酮研磨法[10]、硫代巴比妥酸法[11]；游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD、POD活力测定参照高俊凤的方法[12]。切取幼苗根尖，TTC法测定根系活力[13]。

1.3 数据分析

采用SPSS软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 氮素营养对铁皮石斛组培苗生长的影响

从表1可以看出，铁皮石斛的生根数量随着氮素浓度的提高呈现下降—升高—下降的趋势，说明低氮水平有利于铁皮石斛生根，在供氮水平达10 mmol/L时，平均株高、平均根鲜质量、平均根干质量、平均全株鲜质量、全株干质量、折干率都达到最大值，并且优于高氮处理N5，但N4处理鲜根占全株的比重最低，而干根占比却不是最低，说明此时更多的水分进入了植株的地上部分，地上部分代谢更加旺盛，发育较快。总体看来，低氮水平促进铁皮石斛地下部分的生长，中氮水平地上部分生长快于地下部分，而当氮素水平达到一定水平后，地下部分生长加速，提高了根占比，但在生根数、根长、株高等表观生长指标上各处理间均无显著差异，只有在折干率指标上，各处理呈现显著差异，并以N4处理最高，由此可见一定量的供氮水平对铁皮石斛组培苗干物质积累影响很大。

2.2 不同氮素水平对铁皮石斛根系活力及有机渗透物的影响

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。脯氨酸与可溶性蛋白是非常重要的渗透调节物质，是缺氮胁迫下植物生理变化规律的重要参考指标。由表2可知，在低氮条件下，铁皮石斛根系活力得到加强，随着氮素增加，铁皮石斛根系活力出现下降趋势，氮素水平最低的为N1处理，其根系活力分别是N3、N4、N5处理的1.30、1.40、1.39倍，并且呈显著差异。不同供氮水平下，铁皮石斛体内的脯氨酸和可溶性蛋白含量存在差异，在中低氮水平(N1～N3)下有机渗透物脯氨酸和可溶性蛋白含量随供氮水平的增加而提高，在高氮水平下，随氮素增加而下降。中氮水平(N3)脯氨酸和可溶性蛋白水平最高，脯氮酸与可溶性蛋白含量分别达到0.003 3%和 0.002 3 mg/g，其脯氨酸含量与其他处理呈显著差异。

表1 氮素营养对铁皮石斛组培苗生长的影响

注：不同小写字母表示差异达5%显著水平。下表同。

表2 不同供氮水平对铁皮石斛根系活力及有机渗透物的影响

2.3 不同氮素水平对铁皮石斛叶绿素含量的影响

叶绿素含量直接反映光合作用的强度，氮素是植物体内蛋白质和核酸的重要组成元素，氮素的供应对植物叶绿素的合成有重要的影响。由表3可以看出，铁皮石斛叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量都呈现先升高后降低的趋势，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量在N3处理时达到最大，分别为N1处理叶绿素a、总叶绿素、叶绿素b的1.44、1.41、1.43倍，且其叶绿素a和总叶绿素含量与最低水平N1处理呈显著差异。以上结果表明，氮素的供应对铁皮石斛叶绿素的合成有重要影响，叶绿素的合成需要一定量的氮素供应，但过高的氮素水平对叶绿素的合成有抑制作用。

表3 不同供氮水平对铁皮石斛叶绿素含量的影响

2.4 不同氮素水平对铁皮石斛组培苗活性氧清除系统的影响

MDA作为膜脂过氧化过程中的主要产物之一，其含量的变化可反映细胞膜脂损伤程度[15]。植物体内存在的 SOD、POD 等抗氧化酶系，对清除植物体内的过量活性氧、维持活性氧的代谢平衡、防御膜脂过氧化等具有积极的作用[14]，从表4中可以看出，铁皮石斛植株体内MDA的含量随着供氮水平的不断提高而不断降低，SOD活力随着供氮水平的提高而呈升高—下降—升高的趋势，POD水平在中低氮水平(N1～N3)下随氮素水平增加而提高，在N3时达到最高点后便快速降低。由此可见，低氮胁迫导致铁皮石斛生物膜脂过氧化，SOD、POD等抗氧化酶活性降低，随着供氮水平的提高，SOD、POD等抗氧化酶活力增强，MDA水平下降，但较高的氮素水平首先会抑制铁皮石斛POD的活力。

表4 不同供氮水平对铁皮石斛MDA含量及抗氧化酶活力的影响

2.5 不同氮素水平对铁皮石斛组培苗根茎叶中氮素分布的影响

不同的氮素水平对铁皮石斛根、茎、叶的氮素含量及氮素在根茎叶中的分布有很大影响，从表5中可知，总体上来说，铁皮石斛根茎叶中含氮量随着供氮水平的提高而提高，在根、叶中，当供氮水平为N4处理时，氮素含量快速提高，分别达到38.005、45.228 mg/g，并与N1和N2处理呈显著差异，而茎中的含氮量却在N4处理时呈下降趋势，在N5处理中又大幅度上升。从氮素在铁皮石斛根茎叶中的分布情况来说，在低氮水平(N1、N2)处理时，根的氮素含量水平显著高于茎，并且N2处理时跟中氮素水平显著高于茎叶；在中氮水平(N3、N4)处理时，铁皮石斛根茎叶中的含氮量出现分化，根和叶的含氮量快速增加，并且叶片中含氮量积累速度明显快于根，当氮含量达到N4时，叶片中含氮量达到最大值，并与根呈显著差异性；当供氮水平进一步提高时，叶片中的含氮量不再增加，但根和茎中的含氮量继续提高，且根中含氮量提高的速度快于茎，这说明在氮素缺乏的条件下，铁皮石斛首先保证营养吸收器官(根)的活力，其次是营养合成器官(叶片)，最后是营养贮存器官(茎)。

3 讨论

氮元素是作物必需的营养元素，也是作物生长的重要限制因子[16-17]。在植物的生长过程中，氮素营养含量对植物的生长代谢及生长发育有重要影响。氮素营养水平不仅直接影响含氮化合物(叶绿素、生物碱等)的合成，且与非含氮化合物(类胡萝卜素、类黄酮等)的合成也有密切关系[18]。

在本试验中，不同的供氮水平对于铁皮石斛的生长具有明显的影响，总体呈现先升高再降低再升高的趋势，部分处理间呈现显著差异，在N4水平上，其生根数量、根鲜干质量、全株鲜干质量、平均株高、折干率等方面达到最优，并优于全氮培养的对照，这与尤丽莉等研究[19]一致。但铁皮石斛的根系活力却随着供氮水平的提高而持续降低，可能是由于在轻易得到氮素供应的条件下，植株减缓了根系的发育。

表5 不同供氮水平对铁皮石斛根、茎、叶中氮素分布的影响

注：不同小写字母表示差异达5%显著水平。括号里字母表示横向比较，括号外字母表示纵向比较。

植物叶片中叶绿素合成、SOD和POD活力也受氮素的影响，低氮条件下，叶绿素合成受到抑制，光合作用下降，SOD和POD活力受到抑制，MDA水平升高，随着供氮水平的提高，叶片中叶绿素合成抑制逐步解除，光合作用增强，同时SOD和POD活力增强，MDA水平逐步下降，由此可以看出，MDA含量与抗氧化酶活力系统及叶绿素含量呈现动态平衡，在较高的供氮水平下，叶绿素水平的提高减少了叶片光合作用的过剩光能，降低了过量活性氧的产生，从而降低了对细胞质膜的损害及MDA的产生，而抗氧化酶SOD和POD活力的提高又进一步缓解了这一伤害，MDA水平逐步下降，但过量的氮素并不能进一步提高叶绿素含量，还会对POD活力产生影响，这与前人的研究[20-23]一致。从氮素在植株体内的分布来看，在低水平供氮条件下，植株体内氮素分布较为均一，根部氮素略高于茎叶，在N4水平时，氮素快速向根叶转移。这与叶绿素的合成规律一致。

综上所述，铁皮石斛在低氮(N1、N2)水平下，植株体内代谢处于被抑制状态，N3水平时，植株体内代谢开始恢复，N4水平时，植株体内代谢水平最高，因此铁皮石斛种苗的最佳的供氮水平为5～10 mmol/L。