猪体内定时定点取卵技术的研究

刘西梅， 任红艳， 华再东， 肖红卫， 李 莉， 张立苹， 程 妮， 毕延震

(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064)

体内卵是一种特殊资源，从取卵时间、位置及动物生长发育阶段分析，取到成熟优质的卵是一项耗时、费力、高成本的工作[1-3]。但高质量的体内成熟卵对于体外受精、单精子注射、体细胞克隆、卵子发育研究和应用都是无法有效替代的良好的原始材料[4-6]。单胎生物如牛、人等一次性排卵持续短，取卵时间、地点(位置)易于掌握[7-9]，收卵效率也非常高；而多胎动物猪排卵持续时间长，如不采取人为干预措施，卵的回收效率非常低，而且获得的卵质量参差不齐，动物及卵的利用率非常低[10-11]。本研究利用后备猪，从不同时间、位置采集卵母细胞，以研究定时、定点采卵方法，提高猪体内卵母细胞的收获率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物为后备湖北白猪(母)，体质量约100 kg[12]。

试剂耗材：人绒毛膜促性腺激素(HCG)、孕马血清促性腺激素(PMSG)，均购自宁波激素二厂；收集卵所用溶液为DPBS，购自GIBCO公司[13]。

1.2 试验设计

以不同剂量HCG处理，在不同时间取卵(从输卵管中)，由此筛选出最有效的取卵时间，并以此时间为基准，研究不同剂量处理在输卵管和卵巢中取卵的效果。

1.3 方法

1.3.1 超排处理 主要用PMSG处理，具体剂量、方法等参考魏庆信等的操作程序[12]。

1.3.2 取卵 试验所有取卵均采用手术取卵，取卵溶液DPBS，取卵位置分卵巢和输卵管2个地点，具体操作过程及程序等均参照文献[1-2]；值得注意的是用10 mL注射器接16号及以上型号的针头在卵巢中抽卵最为有效[14-16]。

1.3.3 卵的计数及鉴别 收集的含卵溶液在实体显微镜下仔细挑取所有卵，然后在倒置显微镜上一一鉴别卵的质量分别为未成熟、成熟、老化、裂解[13，17]。

1.4 数据处理

试验数据应用SPSS 17.0软件统计和SNK多重比较法分析和差异显著性比较[18]。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 输卵管取卵时间

试验猪自然发情开始时，用相应剂量的HCG处理，以 12 h 间隔分组，在输卵管冲卵，收集成熟的卵母细胞，各组收卵率见表1。由表1可知，使用HCG的剂量500～1 500 IU，注射后 12 h 在输卵管中冲卵收获率均很低，每头猪只能获得0.17～0.23枚，且注射HCG剂量影响不明显，但剂量有提高收率的趋势；24 h取卵时，500 IU组明显低于其他2组(1 000 IU、1 500 IU)；同样500 IU组，24 h获得卵率也低于其后时间组(36～72 h)，36 h及以后时间组之间变化不明显，但从36 h开始有老化卵现象(退化卵)。由此可见，发情开始注射 1 000 IU HCG，24 h后输卵管取卵是最佳时间，且可以获得最佳取卵效果。

2.2 不同剂量HCG对不同位置取卵数量的影响

猪自然发情开始，用不同剂量HCG处理24 h，分别在输卵管和卵巢中取卵，收获卵的数量见表2。由表2可知，随着HCG使用量增加，输卵管收集卵也越多。其中，1 000 IU及以上剂量组之间差异不明显，但均显著高于0、200、500 IU组(P<0.05)，且这3组之间差异明显。相反在卵巢中取卵，HCG使用剂量越小，取卵越多，而且 1 000 IU 及以上剂量组之间差异不明显，但都显著低于 1 000 IU 以下剂量组(P<0.05)，并且0、200、500 IU单位之间差异显著(P<0.05)。然而，卵巢与输卵管收集卵平均数之和均在12.21～14.28之间，与湖北白猪正常排卵数[1]相一致。从获卵数量和质量综合分析，发现1 000 IU组输卵管取卵、200 IU组卵巢取卵收获率高，残次率低，是一个最有效的收卵时机。

2.3 超排处理对取卵数量的影响

正常发情周期内，距上次发情16～17 d，按1 000 IU/头剂量肌肉注射PMSG[5]，出现发情症状时注射HCG，再过24 h取卵，结果见表3。

表1 自然发情猪注射HCG后取卵时间

注：数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表2 自然发情使用不同剂量HCG后取卵位置与数量变化

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，表3同。

由表3可知，超排处理后，随HCG剂量增加，输卵管(自然排卵)中收集的卵数量依次增加，0、200、500 IU各剂量段显著增加(P<0.05)，1 000 IU以上增加不明显，而从卵巢中抽卵数依次减少，且低剂量时(0、200、500 IU)显著减少(P<0.05)，1 000 IU以上减少不明显。但各剂量组间，输卵管收集卵与卵巢抽卵获卵数均值合计在21.17～22.96，变化不明显。但比较表2和表3，发现自然发情获卵均值合计为 12.21～14.28枚，比超排的21.17～22.96枚少获卵8.99枚，这说明超排能获得更多的卵，这提示超排处理尽管可以排出大量卵，但猪的子宫内着床胚胎的数量有限，产仔数无限增加不合逻辑，所以生产中猪不宜超排。当然，如果仅为获得卵或早期胚胎，超排还是有效的，而且1 000 IU HCG可以起到理想效果，但超排后发育的卵虽然较多，但部分卵发育不同步或发育不全，会致其未成熟。

表3 超排处理猪注射不同剂量HCG后取卵数量比较

3 结论与讨论

试验研究及生产中渴望有大量的优质体内卵，无论是自然发情，还是超排处理，都会有所收获，但最大限度地利用供体猪生产卵才是需求者不断追求的目标，特别是同步化优质的卵[19-21]，这其中除了使用合适剂量排卵激素(HCG)外，定时、定点取卵也非常关键。理论上应该在排卵前2～3 h从卵巢中取卵、排卵后1～2 h内在输卵管中取卵，这对单胎动物不是难事[9]，而多胎动物猪在自然状态下很难做到，这就需要使用合适剂量的排卵激素处理，在合适的位置、合适的时间收集卵[22-23]，本研究结果，在1 000 IU 24 h于输卵管取卵或200 IU 24 h于卵巢取卵，收获的成熟卵最多，可达到理想状态，即实现定时、定点取卵可以在后备猪取得良好效果。