北方春小麦赤霉病镰刀菌种群及其毒素化学型与毒素污染分析

刘笑笑， 王 莹， 仇建飞， 孟繁磊， 魏春雁

[吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业部农产品质量安全风险评估实验室(长春)，吉林长春 130033]

小麦的种植面积仅次于水稻，是我国一半人口的主粮，小麦及其制品的质量安全直接关系到我国的食品安全[1]。北方地区由于气候条件限制，小麦种植基本以春小麦为主。北方春麦区主要包括黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等地区，在全国小麦生产中占有重要地位。小麦赤霉病别称红麦头、麦穗枯、烂麦头，是长江流域冬麦区以及北方春麦区常发性病害，该病是由多种镰刀菌引起的，亚洲镰刀菌(Fusarumasiaticum)和禾谷镰刀菌(F.graminearum)是引起小麦赤霉病的优势致病种群[2-5]。近年来，该病害流行范围明显由南向北转移[6]。镰刀菌不仅影响小麦的产量和品质而造成经济损失，更重要的是其产生的代谢物——镰刀菌毒素，不管是食用还是饲用，对人和畜禽都存在安全风险。镰刀菌毒素对人和畜禽的肝脏、肾脏、细胞免疫机能等都有不同程度的毒性作用，甚至对肿瘤的发生有一定的影响[7-16]，因而镰刀菌毒素被列入自然发生的最危险的食品污染物之一[17-18]。为明确北方春麦区镰刀菌种群结构、毒素化学型分布特点以及毒素污染情况，本研究对2016年采集自北方春麦区(吉林、黑龙江、内蒙古等地区)的55份小麦样品致病种群镰刀菌单孢菌株进行分离、毒素化学型鉴定及单体毒素的定性定量检测，旨在明确镰刀菌在北方春麦区的分布与毒素污染情况，对人们食用安全小麦以及小麦产业健康发展具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试样品 在小麦收割期，从吉林省的松原市、白城市、四平市，黑龙江省的齐齐哈尔市、黑河市(含九三农场)，内蒙古自治区的呼伦贝尔盟、巴彦淖尔盟等7个地区分别收集小麦麦粒，共采集55份样品，每份样品质量为2.5 kg。

1.1.2 化学试剂 马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，简称PDA)培养基，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；引物DNA、琼脂糖N和DNA提取试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；预混DNA聚合酶，购自长春海灵科贸有限公司；甲醇(色谱纯)，购自赛默飞世尔科技公司；甲酸(分析纯)，购自西陇化工股份有限公司；乙腈(色谱纯)，购自山东禹王实业有限公司化工分公司；乙酸(分析纯)，购自天津市化学试剂一厂；玉米赤霉烯酮(zearalenone，简称ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyl-deoxynivalenol，简称3-AcDON)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl-deoxynivalenol，简称15-AcDON)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(deoxynivalenol-3-glucoside，简称D3G)、雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，简称NIV)(纯度≥99%)，均购自北京坛墨质检科技有限公司；琼脂粉，购自北京依托生物。

1.1.3 仪器设备 Presoclave Ⅱ型高压灭菌锅，购自西班牙Selecta公司；SW-CJ超净工作台，购自苏州安泰空气技术有限公司；DNP-9162BS-Ⅲ恒温培养箱，购自上海新苗医疗器械制造有限公司；CX21FS1显微镜，购自日本Olympus公司；C1000 PCR仪(伯乐)，购自长春美信科贸有限公司；DYY-8C 双稳定时电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司；CT15RE台式高速冷冻离心机，购自日立工机株式会社；QTRAP 5500液相色谱-质谱/质谱联用仪，购自美国 AB SCIEX 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 每份样品称取100 g，从中挑选小麦赤霉病病粒。用75%乙醇表面消毒30 s，1% NaClO表面消毒1 min，无菌水漂洗3次，灭菌滤纸吸干水分后分5点摆放在PDA培养基平板中，于25 ℃倒置培养72 h。将小麦籽粒周围长出的所有真菌挑出，转移至另一个新的PDA培养基平板中，25 ℃培养72 h后，在显微镜下观察，带有镰刀状大型分生孢子或椭圆形小型分生孢子的真菌，则为镰刀菌。

用20 mL无菌水将真菌洗掉，使其菌丝、孢子充分混匀，将混合液通过3层擦镜纸过滤，孢子在滤液中，加水稀释，涂至水琼脂培养基平板上，在光学显微镜下镜检，将仅有1个分生孢子的水琼脂转移至PDA培养基平板上，于25 ℃培养 72 h 后挑取新鲜菌丝转入PDA培养基斜面培养，置于4 ℃保存，即获得镰刀菌单孢菌株。

1.2.2 菌丝培养和DNA提取 挑取每个菌株至PDA培养基平皿中，于25 ℃静置培养72 h，收集菌丝用于DNA提取试验。DNA提取采用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB)法。将干净的研砵、研杵、药匙灭菌备用，将CTAB提取液置于65 ℃水浴锅中预热，先加入少量灭菌的石碤砂，然后加入适量菌丝体再加入 1 000 μL 事先预热的CTAB，迅速研磨后分装于离心管中，反复颠倒，使其迅速混溶，65 ℃水浴1 h，其间每隔15 min拿出颠倒混匀1次。取出冷却后，加入等体积的苯酚氯仿，轻轻翻转混匀后，于常温14 000 r/min条件下离心10 min，转移上清液至新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻转动离心管，待白色絮状沉淀出现，或可放置-20 ℃冰箱30 min以上，于常温8 000 r/min条件下离心5 min，倒干上清液，加入 1 000 μL 75%乙醇，轻轻摇匀，8 000 r/min离心5 min，漂洗2次，晾干后，加适量TE缓冲液，4 ℃溶解。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.2.3 镰刀菌种的鉴定 采用Yang等的研究方法[3，6]，对84株镰刀菌用FgCTPSf024、FgCTPSr536、FgCTPSf177、FgCTPSr306等4条引物进行竞争PCR扩增，此为第1组竞争PCR扩增。采用25 μL扩增体系：1.0 μL DNA模板，2.0 μL dNTPs，2.5 μL PCR缓冲液，0.5 μLTaq酶，1.0 μL FgCTPSf 177，1.0 μL FgCTPSr306，0.5 μL FgCTPSf024，0.5 μL FgCTPSr536，用无菌水补至25 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。用FgTEFf124、FgTEFf364、FgTEFr411、FgTEFr590等4条引物进行第2组竞争PCR扩增。4条引物分别添加 0.50、0.50、0.25、0.25 μL，其他组分和扩增反应程序与第1组竞争PCR相同。

对于非禾谷镰刀菌群(F.graminearumclade，简称Fgclade)菌株，用燕麦镰刀菌(F.avenaeum)种的特异性引物(FaF/FaR)进行PCR扩增，反应体系中引物分别添加1 μL，其他组分与上述反应体系相同。PCR扩增反应程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。以上PCR产物均用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.4 毒素化学型的测定 测定DON和NIV毒素化学型时，使用TOXP1和TOXP2引物，各0.5 μL，其他反应组分同“1.2.3”节。PCR扩增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。采用Jennings等的方法[19]对DON毒素化学型的菌株进行3-AcDON和 15-AcDON 鉴定。2个PCR反应所须引物分别为0.5 μL Tri303F/Tri303R、0.5 μL Tri315F/Tri315R，其他反应组分同“1.2.3”节。扩增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物均用1%琼脂糖凝胶电泳进行测定。引物序列见表1。

1.2.5 镰刀菌毒素检测 准确称取5.000 g小麦样品(麦粒磨成的麦粉)于离心管中，加入25 mL提取液(乙腈、水、乙酸的体积比为80 ∶19 ∶1)，振荡1.5 h，超声提取30 min，14 000 r/min 离心15 min，取1 mL上清液，过0.22 μm有机微孔滤膜，上液相色谱-质谱/质谱仪进行测定。色谱条件：色谱柱为Kinetex SB-C18，2.1 mm×100 mm×1.7 μm；柱温为 40 ℃；进样量为3 μL；流动相组成：A相为10%甲醇(含0.1%甲酸)，B相为甲醇；流速为0.3 mL/min。质谱条件：电离源模式为电喷雾离子化；电离源极性为正负模式同时扫描；雾化器为氮气；检测方式：多离子反应监测。

2 结果与分析

2.1 病原菌菌株的分离与致病菌种群结构分析

共分离获得84株单孢菌株，各地分离的单孢菌株情况见表2。84株单孢菌株中，共检测到亚洲镰刀菌、F.acaciae-meansii、燕麦镰刀菌、F.meridionale、禾谷镰刀菌等5个镰刀菌种。除内蒙古巴彦淖尔盟地区外，其余采样地区均检测到禾谷镰刀菌菌株，占所有菌株的42.86%；其次有2个采样地区检测到亚洲镰刀菌，占所有分离菌株的27.38%。各采样地区的镰刀菌致病种存在差异，吉林省镰刀菌种群相对复杂，检测到5个镰刀菌菌种；黑龙江省检测到F.acaciae-meansii、F.meridionale、禾谷镰刀菌等3个种；内蒙古检测到亚洲镰刀菌、燕麦镰刀菌、禾谷镰刀菌等3个种，且主要集中在亚洲镰刀菌和禾谷镰刀菌2个种。这与Gale等的研究结果[4-5]一致。亚洲镰刀菌在吉林省的小麦赤霉单孢分离物中检测到12株，在内蒙古检测到2株，该结果与Parry报道的亚洲镰刀菌主要分布于凉爽或海洋性气候地区[4]较为吻合。

表2 不同采样地点镰刀菌种群分布情况

2.2 PCR鉴定结果

由图1可知，亚洲镰刀菌菌株扩增出4条条带，分别为536、388、311、162 bp，引物FgCTPSf177和FgCTPSr306在亚洲镰刀菌菌株上扩增出162 bp的特征条带；FgCTPSr306和FgCTPSf024在Fgclade中扩增出311、536 bp的特征条带； FgCTPSf024和FgCTPSr536在F.meridionale菌株上扩增出536 bp的特征条带。

由图2可知，Fgclade菌株扩增出482 bp条带，禾谷镰刀菌菌株扩增出261 bp条带，F.acaciae-meansii扩增出306 bp条带。而燕麦镰刀菌菌株扩增出920 bp特征带。

由图3、图4可知，用引物ToxP1/ToxP2区分DON和NIV毒素，DON毒素的特征条带为300 bp，NIV毒素的特征条带为360 bp。DON毒素菌株中，引物Tri303F/Tri303R扩增出583 bp条带的菌株为3-AcDON，引物Tri315F/Tri315R扩增出863 bp条带的菌株为15-AcDON。

2.3 镰刀菌毒素化学型分析

由表3可知，DON和NIV毒素化学型之间存在明显的地域分布。DON毒素化学型是北方春麦区赤霉病病菌的优势毒素类型，而NIV毒素化学型仅在吉林省麦区出现。在产生DON毒素化学型的菌株中，北方春麦区DON毒素类型均以15-AcDON为主。zhang等研究表明，DON是我国小麦赤霉病病菌产生主要的毒素化学类型，且北方冷凉地区以产生 15-AcDON为主，南方温暖地区以产生3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-AcDON)为主[5，20-21]，本研究结果与上述观点一致。菌株产生乙酰DON毒素的类型与该菌株所属种存在一定关系。亚洲镰刀菌、燕麦镰刀菌、禾谷镰刀菌等3种菌株主要产生15-AcDON；F.acaciae-meansii和F.meridionale这2种菌株只产生15-AcDON。

2.5 镰刀菌毒素检测结果与分析

对北方春小麦中雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇等6种B型镰刀菌毒素进行测定。结果显示，3个省(自治区)7个市(盟)所有被检样品中，6种毒素均未检出。可能是病害程度较轻，毒素水平很低，再者可能是小麦皮对籽粒起到了保护作用。6种毒素的检出限见表4。

3 结论

北方春麦区小麦镰刀菌病害预防应以亚洲镰刀菌和禾谷镰刀菌为主，生物毒素污染预防应以15-AcDON为主；6种B型镰刀菌生物毒素在被检样品中均未检出，表明北方春麦区小麦整体质量安全水平较高。

表3 各省镰刀菌毒素化学型分布情况

表4 镰刀菌毒素检出限