响应面法优化鹿角灵芝产胞内多糖的液体发酵工艺

徐 慧， 赵双枝， 刘孝永， 张彦昊， 陈蕾蕾

(山东省农业科学院农产品研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业部新食品资源加工重点实验室，山东济南 250100)

灵芝是我国传统名贵大型真菌[1-2]，可用于辅助治疗肿瘤、调节免疫力、抗氧化、防衰老等，灵芝多糖是其主要功能活性物质之一[3-8]。鹿角灵芝是一种表面具有漆样光泽、菌柄长、有多个分支、形似鹿角、因生长外界条件变化而异型生长的灵芝菌株，在自然条件下极为罕见，多通过人工培养方式获取。传统灵芝多糖主要从灵芝孢子粉和子实体中提取，近年来的研究显示，通过深层发酵提取的灵芝多糖，较传统方式的得率和功效具有优势[9-10]。刘艳芳等对同种灵芝子实体、菌丝体和孢子粉多糖成分进行了比较，发现灵芝菌丝体中多糖含量最高，孢子粉中多糖含量次之，子实体中多糖含量最低[11]。在对小鼠巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮(NO)产量的影响研究中发现，从菌丝体和子实体中提取的多糖活性表现良好，而孢子粉多糖呈低活性状态，表明从灵芝菌丝体中制得的灵芝多糖具有产量高、活性优的特点。于浩瀚等以8个灵芝菌株为研究对象，比较菌丝体多糖、子实体的多糖含量发现，血芝的菌丝体多糖含量为子实体的30倍，进而证实通过深层发酵获得灵芝多糖是切实可行的[12]。随着生活水平的提高，人们的保健意识逐渐增强，仅靠传统方式制取灵芝多糖已经远远不能满足现在人们的需求，加上灵芝液体深层发酵生产的灵芝菌丝体胞内多糖具有产量高、质量稳定、生产周期短、成本低廉等优势，适合用于产业化生产，是目前制备灵芝多糖的热点研究领域[13-14]。

响应面法是一种通过对响应值逼近来预测真实值的试验设计方法。运用响应面法不仅可以得到最优试验方案，还可获得变量和响应值之间的变化趋势，达到减少试验次数的目的，具有指导工艺参数优化、提高生产效益的优势[15-16]。本试验以鹿角灵芝液体发酵产胞内多糖得率为指标，对鹿角灵芝的液态发酵工艺进行单因素和响应面法优化，以期为液态发酵法生产鹿角灵芝多糖的工艺制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与原料 鹿角灵芝(GanodermaamboinenseNCPSLZ1)菌种，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号：M2015796。马铃薯，市售；麦麸，市售；大豆粉，市售。

1.1.2 培养基的配制 菌种保存及活化培养基：20%马铃薯、3%麦麸、3%葡萄糖、0.2% KH2PO4、0.1% MgSO4、2%琼脂，pH值=7.0。将马铃薯洗净，去皮，切成小块，加麦麸和蒸馏水煮沸30 min，过滤。向滤液中趁热加入其他试剂，融化后用试管分装，于121 ℃灭菌30 min，制成试管斜面备用。

种子培养基：菌种培养基配方中不添加琼脂，融化后根据需要分装于三角瓶内，于121 ℃灭菌30 min备用。

1.2 仪器与设备

ZWY-2102恒温培养振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司；5804R台式离心机，上海安亭科学仪器厂；BL-58A灭菌锅，上海博迅实业有限公司；超净工作台，上海力申科学仪器有限公司；BPH-9000电热恒温鼓风干燥箱，北京医疗设备厂；WB-200水浴锅，郑州长城科工贸有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化 从保存母种的试管斜面中切出大豆大小的菌丝块，接于斜面培养基的中部，于(27±2) ℃培养7 d。

1.3.2 种子液的制备 取大豆大小的活化菌丝块3～4块，接种于种子液培养基中，500 mL三角瓶装液量为 300 mL，于(27±2) ℃、150 r/min摇瓶培养7 d。

1.3.3 发酵液的制备 取适量种子液接种于发酵培养基中，于(27±2) ℃、150 r/min摇瓶培养，分别考察碳源、氮源、马铃薯添加量与初始pH值、接种量、装液量对鹿角灵芝菌丝体胞内多糖含量的影响。

1.3.4 鹿角灵芝胞内多糖的提取 将鹿角灵芝发酵液于 6 000 r/min 离心15 min，收集菌丝体，将菌丝体用蒸馏水多次洗涤并离心后真空冷冻干燥备用。取1 g冻干鹿角灵芝菌丝体，加50 mL蒸馏水煮沸提取60 min，过滤，滤渣重复提取1次，过滤，合并2次滤液，加3倍体积的无水乙醇混匀，于 4 ℃ 静置12 h，离心，在沉淀中加适量蒸馏水复溶，即得鹿角灵芝胞内多糖粗提液。

1.4 鹿角灵芝多糖的测定方法

1.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制 准确称取10 mg葡萄糖(于104 ℃烘干至恒质量)，定容于100 mL容量瓶中，配制成浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖母液。准确吸取浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于具塞试管中，分别补水至2.0 mL。然后各准确加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5 mL硫酸，摇匀，置于40 ℃水浴保温15 min，取出并迅速用流水冷却至室温，于490 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.2 多糖含量测定 准确吸取1 mL鹿角灵芝多糖粗提液，稀释50倍，取1 mL稀释液，补水至2 mL，准确加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸，摇匀，于40 ℃水浴保温15 min，取出并迅速用流水冷却至室温，于490 nm处测定吸光度。以蒸馏水为空白对照，根据葡萄糖标准曲线计算鹿角灵芝胞内多糖含量。

1.4.3 鹿角灵芝胞内多糖含量的计算 将样品真空冷冻干燥后制得鹿角灵芝胞内多糖，测定多糖含量，按照以下公式计算鹿角灵芝胞内多糖得率：

式中：C为多糖含量，mg；V为提取液体积，mL；m为冻干菌丝体质量g。

1.5 单因素试验

以鹿角灵芝胞内多糖含量为指标，分别考察碳源含量、氮源含量、装液量、接种量、初始pH值和马铃薯添加量对鹿角灵芝产胞内多糖得率的影响，最终确定各个单因素最适水平及对鹿角灵芝胞内多糖影响显著的单因素。

1.5.1 碳、氮源筛选试验 分别以2%葡萄糖、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作为碳源，添加2%麦麸、20%马铃薯、0.2% KH2PO4和0.1% MgSO4，配成7种不同碳源的发酵培养基进行碳源的筛选试验。分别以2%麦麸、(NH4)2SO4、酵母膏和大豆粉作为氮源，添加2%葡萄糖、20%马铃薯、0.2% KH2PO4和0.1% MgSO4，配成4种不同氮源的发酵培养基进行氮源的筛选试验。

1.5.2 单因素试验 在优选碳、氮源的基础上，分别考察碳源添加量、氮源添加量、装液量(500 mL三角瓶装液量分别为50、100、150、200、250 mL)、接种量(5%、10%、15%、20%)、初始pH值(3、5、7、9、11)、马铃薯添加量(5%、10%、15%、20%、25%)对鹿角灵芝胞内多糖得率的影响，培养温度为(27±2) ℃，转速为150 r/min，培养82 h。

1.6 Box-Behnken试验设计与响应面分析

在单因子试验结果的基础上，经过显著性分析，选取对鹿角灵芝胞内多糖影响显著的装液量、接种量和葡萄糖添加量作为自变量，进行3因素3水平的响应面分析试验。采用Design Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken试验设计并对试验结果进行响应面分析，建立响应面回归模型[15-16]。对拟合的回归方程进行方差分析，确定最优工艺参数及最优响应因子水平，并进行模型验证。响应面试验因素水平设计见表1。

1.7 数据处理与分析

所有试验均重复3次。单因素试验数据分析及作图采用Origin 8.5软件，单因素方差分析及显著性比较采用SPSS软件，多重比较采用LSD检验法。响应面试验设计、数据处理、作图及方差分析均采用Design Expert 8.0.5b软件。

表1 响应面分析法试验设计因子水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 葡萄糖标准曲线 以葡萄糖含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(图1)，并得到回归方程：y=8.542x-0.007，r2=0.999。

2.1.2 碳源筛选结果 从图2可以看出，以葡萄糖、玉米粉和可溶性淀粉为碳源时，鹿角灵芝菌丝体的胞内多糖得率较高，而以山梨醇、蔗糖、乳糖和麦芽糖作碳源时，不利于鹿角灵芝胞内多糖的累积，因此以葡萄糖作为最适碳源。

2.1.3 氮源筛选结果 从图3可以看出，以麦麸和酵母膏作为氮源有利于鹿角灵芝液体发酵菌丝体胞内多糖的累积，其中，以麦麸作为氮源时，胞内多糖得率最高，而麦麸价格低廉易得，因此，本研究以麦麸作为最适氮源。

2.1.4 碳源添加量 从图4可以看出，葡萄糖添加量对鹿角灵芝菌丝体胞内多糖得率的影响较大。随着葡萄糖添加量的增加，胞内多糖得率呈先显著上升后显著下降的趋势，当葡萄糖添加量为3%时，鹿角灵芝胞内多糖得率达到最高值，因此葡萄糖添加量以3%为宜；当葡萄糖添加量为2%～4%时，鹿角灵芝胞内多糖得率较高，且不同水平间存在显著差异。

2.1.5 氮源添加量 从图5可以看出，当麦麸添加量为 1%～5%时，随着麦麸添加量的增大，鹿角灵芝胞内多糖得率呈先上升后下降的趋势；当麦麸添加量为3%时，鹿角灵芝胞内多糖得率达到大值，故麦麸添加量以3%为宜；当麦麸添加量为2%～4%时，鹿角灵芝胞内多糖得率较高，但不同水平间差异不明显。

2.1.6 装液量 从图6可以看出，当500 mL三角瓶装液量为50～250 mL时，对鹿角灵芝胞内多糖得率的影响显著。随着装液量的加大，鹿角灵芝胞内多糖得率呈现先显著上升后显著下降的趋势；当500 mL三角瓶装液量为150 mL时，鹿角灵芝胞内多糖得率最高，故500 mL三角瓶装液量以150 mL为宜。当500 mL三角瓶装液量为100 ～200 mL时，鹿角灵芝胞内多糖得率较高，且不同水平间差异显著。

2.1.7 接种量 从图7可以看出，随着接种量的加大，鹿角灵芝胞内多糖得率首先呈显著上升的趋势，当接种量为10%时，鹿角灵芝胞内多糖得率达最高值，之后随接种量的增大，鹿角灵芝胞内多糖得率的变化不明显，因此可见，接种量以10%为宜。在接种量为5%～20%范围内，5%～15%的接种量对鹿角灵芝胞内多糖得率的影响显著。

2.1.8 初始pH值 从图8可以看出，随着初始pH值的增加，鹿角灵芝胞内多糖得率呈先上升后下降的趋势，当pH值为7时，鹿角灵芝胞内多糖得率最高，因此初始pH值以7为宜。当pH值为5～9时，鹿角灵芝胞内多糖得率较高，但不同水平间差异不明显。

2.1.9 马铃薯添加量 从图9可以看出，在马铃薯添加量为5%～20%的范围内，随着马铃薯添加量的增加，鹿角灵芝胞内多糖得率呈上升趋势，当马铃薯添加量为20%时，鹿角灵芝胞内多糖得率最高，因此，马铃薯添加量以20%为宜。当马铃薯添加量为15%～25%时，鹿角灵芝胞内多糖得率较高，且添加量为20%、25%与添加量为15%间差异显著。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 回归模型的建立 在单因素试验结果的基础上，固定麦麸添加量为3%，马铃薯添加量为20%，初始pH值为7.0，采用中心组合设计方法，对装液量(A)、接种量(B)和葡萄糖添加量(C)进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计，结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

采用Design-Expert 8.05对数据进行多元回归拟合，得到装液量(A)、接种量(B)和葡萄糖添加量(C)对鹿角灵芝胞内多糖得率(Y)的回归方程：Y=12.95+0.17A+0.53B+0.97C-0.13AB-0.09AC+1.09BC-4.54A2-2.03B2-1.88C2。

2.2.2 回归模型的方差分析 对响应面试验结果进行方差分析，由表3可以看出，本试验建立的多元回归模型中P<0.000 1，表明回归模型极显著，说明不同处理间差异极显著；模型失拟项P>0.05，说明模型失拟项不显著，试验误差较小[17]。模型决定系数R2=0.996 9，校正后的决定系数RAdj=0.993 0，表明该模型能较好地拟合实际试验中响应值的变化，该回归模型能对胞内多糖得率进行分析和预测。变异系数(CV)表示模型的置信度[18]，CV与模型置信度成反比，本模型的CV为2.81%，表明该模型能较好地体现试验值。其中，B、C、BC、A2、B2、C2对鹿角灵芝胞内多糖得率有极显著影响(P<0.000 1)，A、AB、AC对鹿角灵芝胞内多糖得率影响不显著。各影响因素对鹿角灵芝胞内多糖得率的影响依次是C(葡萄糖添加量)>B(接种量)>A(装液量)。

表3 响应面试验结果方差分析

注：“*”表示影响显著(P<0.05)；“**”表示影响极显著(P<0.01)。R2=0.996 9，RAdj=0.993 0，CV=2.81%。

2.2.3 响应面分析 图10至图12反映了接种量、装液量和葡萄糖添加量与响应值鹿角灵芝胞内多糖得率的关系。响应面三维图和等高线图能反映2个变量间的相互作用，此时其他变量处于中心水平。响应面图中响应面的变化弧度平缓，表明试验因素对响应值影响程度较小，反之则表示影响较大；等高线形状反映因素间交互影响的强弱，椭圆形表示因素间交互影响显著，圆形则表示交互作用影响不显著[19-22]。由图10、 图11可知， 装液量对鹿角灵芝胞内多糖得率的影响大于接种量、葡萄糖添加量。由图12可知，响应面弧度陡峭，等高线呈椭圆形，说明接种量和葡萄糖添加量都对鹿角灵芝胞内多糖得率有交互影响，且二者的交互影响显著。

2.2.4 模型验证 通过对鹿角灵芝液体发酵工艺的优化，得到鹿角灵芝胞内多糖得率的最佳工艺条件：装液量为 150.58 mL，接种量为11.08%，葡萄糖添加量为3.32%，在此条件下鹿角灵芝胞内多糖得率为13.16%。 考虑到试验实际操作性，将最佳发酵工艺调整为装液量151 mL、接种量11%、葡萄糖添加量3.3%。在此工艺条件下做5次平行试验进行验证，得到鹿角灵芝胞内多糖的实际得率为12.94%，与预测值相对误差小于5%，表明该方程与实际情况拟合良好，相应优化模型真实可行，具有指导生产的实用价值。

3 讨论

灵芝多糖是灵芝中发现较早的有效成分，也是衡量灵芝保健功能的一个主要指标。之前的研究已证明，灵芝菌丝体中的灵芝多糖的含量普遍高于传统人工栽培或野生灵芝中的灵芝多糖含量[23]，加上液态深层发酵技术的日趋成熟，使得深层发酵制备灵芝多糖变成获取灵芝功能成分的主要方向[24-27]。

深层发酵是一种将微生物细胞置于底物中培养，最终达到表面培养形成鲜明对照状态的技术。随着抗生素发酵技术的发展，食用菌深层发酵工艺也逐渐成为研究热点，目前，灵芝深层发酵的研究主要集中在培养基和发酵工艺优化方面。有研究发现：灵芝深层发酵多以葡萄糖、蔗糖、玉米粉为最适碳源，且碳源添加量不宜超过3%，这是由于灵芝为低糖发酵，糖浓度过高会造成菌丝体细胞脱水死亡[28]；氮源是灵芝深层发酵的重要成分，有机复合氮源比无机氮源更有利于功能成分的合成；由于钾对糖酵解有促进作用，糖代谢过程受磷酸盐的影响，镁影响碳源的氧化，因此灵芝深层发酵中最重要的无机盐为钾、镁、磷酸盐[29]；深层发酵中的装液量会影响溶氧量，而氧含量对多糖合成又有显著促进作用，因此装液量通常为30%左右[30]。从试验结果可以看出，本研究优化得到的鹿角灵芝液体发酵产胞内多糖工艺条件，与前人研究灵芝液体发酵产胞内多糖条件相近。谭才邓等以灵芝胞内多糖为指标，采用麦芽糖含量为2%、酵母提取粉含量为2%、ZnSO4含量为0.015%、维生素B1含量为0.1%、KH2PO4含量为0.2%、MgSO4含量为0.05%的培养基组合，最终胞内多糖产量为6.64%[31]。相比之下，本试验培养基的优势在于构成简单，原料利用了农产品及加工副产物，价格低廉，且经响应面优化灵芝胞内多糖得率达12.94%，高于相关文献报道的灵芝深层发酵胞内多糖得率，但本试验参数为摇瓶水平，扩大生产培养至生产水平仍需进一步进行优化试验作理论参考。

4 结论

本试验以鹿角灵芝胞内多糖得率为指标，通过单因素试验和响应面法优化液体发酵培养工艺，确定最佳发酵工艺条件为20%马铃薯、3.3%葡萄糖、3%麦麸、0.2% KH2PO4、0.1% MgSO4，初始pH值=7.0，接种量为11%，500 mL三角瓶装液量为151 mL，转速为150 r/min，发酵时间为82 h。在此发酵工艺下，鹿角灵芝胞内多糖得率为12.94%，与优化模型预测值13.16%相比，相对误差小于5%，表明该优化模型真实可行，对生产有一定的实用价值。