淫羊藿药渣总氨基酸水解液分析及其制备工艺优化

杨 勇， 杨小生， 杨 玲， 杨 娟

(1.贵州大学药学院，贵州贵阳 550025； 2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550014)

随着我国中药资源的迅速推广与利用，全国各大药企的药渣废弃量日益增加，年排放量达3 000万t[1]。当前，药渣被广泛应用于众多行业中，如造纸、栽培食用菌、生产有机肥、处理废水和用作饲料添加剂等[2]。药渣中除了含有粗纤维、粗蛋白质和微量元素等营养成分外，还残留一定量的多糖、黄酮[3]和萜类等生物活性成分。如何高值化利用这些功能性成分成为当前研究的热点。

氨基酸作为机体必需的营养素，对其进行分析是利用该营养素的必要前提[4]。总氨基酸含量分析的方法有凯氏定氮法、茚三酮显色法、考马斯亮蓝法、高效液相色谱(HPLC)柱前/柱后衍生化法[5]等。茚三酮显色法在氨基酸定量分析中具有灵敏度高、成本低廉、过程简易、分析迅速等优点[6]。但是，由于不同样品含氮组分比例不同，茚三酮显色法对于不同样品的氨基酸含量测定都会产生一定误差。因此，本试验以高效液相色谱法和凯氏定氮法测定值作为参考指标，考察茚三酮显色法对淫羊藿药渣水解液中总氨基酸定量分析的适用性和准确性。

淫羊藿经水提后，药渣中仍剩余大量的功能性成分，如粗蛋白、总黄酮、萜类等。因此，将淫羊藿药渣作为禽畜类饲料添加剂加以利用，不仅能增强禽畜的抗病能力[7]，还能促进禽畜生长发育。但是，禽畜对淫羊藿药渣的适应性较差，采食量较少。本试验考虑将淫羊藿药渣制成总氨基酸水解液，以快速简捷的氨基酸定量分析方法为基础，优化淫羊藿药渣总氨基酸水解液制备工艺，为高效开发与利用淫羊藿药渣功能性成分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

淫羊藿药渣，由贵州同济堂制药有限公司提供；活性炭；精密pH试纸；内螺纹式消解管，购自盐城庆胜实验室装备有限公司；浓硫酸、硼砂，均为优级纯；其余试剂均为分析纯。

UV-1800紫外-可见分光光度计；L-8900日立全自动氨基酸分析仪；SKD-100自动凯氏定氮仪；JKXZ06-20B恒温消煮仪；FE-20K pH计；GZX-9023电热鼓风干燥箱；AG285梅特勒-托利多电子分析天平。

1.2 茚三酮显色法

1.2.1 样品预处理 酸水解法：精确称取100 mg干燥至恒质量的样品，置于15 mL消解管中，加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液，然后置于(110±1) ℃烘箱中水解20～24 h，取出冷却、过滤，调节至pH值为9.0[8]左右，脱色、过滤、离心，转移上清液至50 mL容量瓶中，定容，作为供试品溶液。

1.2.2 对照品溶液的配制 精确称取0.1 g干燥至恒质量的L-天门冬氨酸标准品，配制成1.00 mg/mL天门冬氨酸溶液，取该溶液稀释10倍，即得100 μg/mL天门冬氨酸对照品溶液。

1.2.3 测定方法的考察

1.2.3.1 最大吸收波长的确定 取适量对照品溶液与供试品溶液，以水作为空白对照，于200～800 nm扫描最大吸收波长[9]，结果显示，对照品无吸收峰，且供试品吸收峰不明显。因此考虑加显色剂，观察结果。

1.2.3.2 磷酸盐缓冲液用量的考察 精确移取1.0 mL对照品溶液至10 mL具塞刻度试管中，加水补足至2.0 mL[10]，以 1.0 mL 纯水作为空白对照，分别加入pH值为6.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，各加入1.0 mL 2.0%茚三酮溶液，于沸水浴中加热15 min，冷却，于567 nm处测定吸光度。

1.2.3.3 磷酸盐缓冲液pH值的考察 与第“1.2.3.2”节同法操作，考察NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.5、8.0时对吸光度测定的影响。

1.2.3.4 显色剂用量的考察 与第“1.2.3.2”节同法操作，考察显色剂(2.0%茚三酮)用量分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL时对吸光度测定的影响。

1.2.3.5 沸水浴加热时间的考察 与第“1.2.3.2”节同法操作，考察沸水浴加热时间分别为10、15、20、25、30、35、40 min 时对吸光度测定的影响。

1.2.4 供试品方法学的考察

1.2.4.1 精密度试验 精确移取1.0 mL供试品溶液，共9份，进行9次试验(n=9)，按照第“1.2.3.2”节方法处理，测定吸光度。

1.2.4.2 稳定性试验 精确移取1.0 mL供试品溶液，共9份，进行9次试验，按照第“1.2.3.2”节方法显色，分别于0、10、20、30、40、50、60 min后测定吸光度。

1.2.4.3 重复性试验 精确称取100 mg同一批次的淫羊藿药渣，共9份，进行9次试验，按照第“1.2.1”节的方法制备供试品溶液，每份精确移取1.0 mL该供试品溶液，按照第“1.2.3.2”节方法处理，测定吸光度。

1.2.4.4 回收率试验 精确称取100 mg淫羊藿药渣粉末，共9份，进行9次试验，按照第“1.2.1”节方法制备供试品溶液(经预试验，测定100 mg样品约含总氨基酸6.054 mg)，每份均精确加入5.0 mg天冬氨酸对照品，按照第“1.2.3.2”节方法处理，测定吸光度。

1.2.5 绘制标准曲线与供试品总氨基酸含量的测定 茚三酮-紫外可见分光光度法：取9支试管，分别加入0、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL 100 μg/mL天门冬氨酸标准溶液，加水补足体积至2.0 mL，加2.0 mL pH值为6.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，最后每管加1.0 mL显色剂，摇匀，于100 ℃水浴加热15 min，测定吸光度，平行3次测定，绘制标准曲线。供试品同法操作，测定吸光度。总氨基酸含量计算公式如下：

Y=mV1/(1 000m1V2)×100%。

式中：Y为氨基酸含量，%；m为试样中氨基酸质量，μg；V1为供试品溶液总体积，mL；V2为测试用供试品溶液体积，mL；m1为试样质量，mg。

1.3 高效液相色谱法

试验通过日立全自动氨基酸分析仪L-8900，采用茚三酮柱后衍生化法[11]进行氨基酸定量分析。试剂衍生化处理与具体分析过程参照GB/T 16631—2008《高效液相色谱法通则》。

1.4 全氮含量测定(凯氏定氮法)

通过SKD-100自动凯氏定氮仪测定全氮含量，测定参照朱杰等的方法[12-13]。

1.5 总氨基酸酸水解液制备工艺优化

1.5.1 单因素试验 考察盐酸浓度(2、4、6、8、10 mol/L)、水解时间(12、16、20、24、28 h)、水解温度(100、105、110、115、120 ℃)3个因素的影响，将其中1个单因素作为变量，在其他2个条件相同的前提下，考察该因素对淫羊藿药渣中氨基酸提取率的影响。

1.5.2 响应面分析 在单因素试验的基础上设计中心组合试验，选取3个因素中合适的梯度范围作响应面分析，优化总氨基酸水解液制备工艺。

1.5.3 优化酸水解后氨基酸提取率测定 以茚三酮显色法测得的氨基酸含量作为氨基酸提取率的结果，测定参照第“1.2.3.2”节的方法。

2 结果与分析

2.1 茚三酮显色法测定结果

2.1.1 方法考察结果与分析 方法考察结果显示，加显色剂后，扫描最大吸收波长时，200～800 nm光谱范围内有2个明显吸收峰，但200～440 nm处吸收峰有拖尾现象，且分离度较低，可能会造成较大的试验误差，而在500～700 nm处吸收峰呈单峰，峰形明显，对称性良好，因此取该波段的最大吸收波长567 nm作为本试验的检测波长。当磷酸盐缓冲液用量为2.0 mL、pH值为6.0、显色剂用量为1.0 mL时，吸光度最大，反应最完全；当沸水浴加热时间为15 min时，吸光度达到最大值，超过15 min后，显色剂有氧化趋势，溶液逐渐由紫色转变成棕黄色，在567 nm处不再出现明显的吸收峰。因此，考虑沸水浴加热时间为15 min。

2.1.2 供试品方法学考察结果 本研究显示，在考察精密度时，9组供试品溶液的吸光度相对标准偏差(RSD)为0.69%，说明此方法符合样品的精密度测试要求；在考察稳定性时，9组供试品溶液在40 min内测定，吸光度的RSD<2%(40 min时测定吸光度的RSD为1.98%)，而当50 min时测定，9组供试品溶液的吸光度RSD>2%。因此可见，本试验显色后测定吸光度尽量应控制在40 min内完成，才能符合该样品的稳定性测试要求；进行重复性试验考察时，9组供试品溶液总氨基酸平均含量为6.05%，RSD为1.5%，表明该方法重复性较好。加样回收率试验考察结果见表1，可见该方法的分析误差在±2.0% 范围内，在氨基酸微量分析中符合要求。

表1 供试品总氨基酸含量测定的加样回收率试验

注：RSD=0.69%。

2.1.3 供试品总氨基酸含量测定结果 通过紫外-可见分光光度法，绘制得标准曲线方程为y=0.018 5x-0.790 1，r2=0.995 1，使用方法考察的最佳检测条件进行3组平行试验，茚三酮显色测得淫羊藿药渣中总氨基酸含量平均为6.12%。

2.2 高效液相色谱法测定结果

淫羊藿药渣水解液中含有绝大多数天然氨基酸，以天门冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸为主，天门冬氨酸含量最高，为1.03%(保留时间为31.074 min)，总氨基酸含量为4.29%。高效液相色谱结果见图1。

2.3 凯氏定氮法测定结果

本研究测得淫羊藿药渣中全氮平均含量为6.58%，高于高效液相色谱法和茚三酮显色法的检测结果。

2.4 3种测定方法的结果比较

用茚三酮显色法、高效液相色谱法、凯氏定氮法测得淫羊藿药渣中全氮含量分别为6.12%、4.29%、6.58%。由于淫羊藿药渣中的氮主要以有机氮和无机氮的形式存在[14]，其中氨氮是指以氨、铵离子或以NHx形式存在的氮[15]，氨基氮是指各种氨基化合物(主要是氨基酸)[16]，总氮包括氨、铵及硝酸盐等所有氮化物的总和。根据茚三酮显色的原理[17]，茚三酮显色法测得结果为氨氮的百分含量，高效液相色谱法测得结果为氨基氮(氨基酸)的百分含量，而凯氏定氮法测得结果为总氮的百分含量。因此，从理论上分析，茚三酮显色法测定结果应介于高效液相色谱法与凯氏定氮法测定值之间，实际测定结果符合理论分析的参考范围。

2.5 总氨基酸水解液制备工艺优化结果

2.5.1 单因素考察试验结果 由图2可以看出，随着盐酸浓度的增加，氨基酸提取率先呈提高趋势，当盐酸浓度达到 6 mol/L 时，氨基酸含量最高，当超过此浓度时，氨基酸含量不再明显升高。因此，选择盐酸浓度为4、6、8 mol/L进行后续响应面设计试验。

由图3可以看出，随着水解时间的延长，氨基酸提取率先呈提高趋势，当水解时间达到24 h时，氨基酸已经水解完全，继续延长水解时间，可能会使部分氨基酸发生氧化，使检测结果偏低。因此，选择水解时间为20、24、28 h进行后续响应面设计试验。

由图4可以看出，当水解温度达到115 ℃时，氨基酸提取率最高，继续升高温度，则氨基酸提取率不再明显升高。因此，选择水解温度为105、110、115 ℃进行后续响应面设计试验。

2.5.2 响应面法结果与分析 通过Design-Expert 8.05b软件对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程[18]：

氨基酸提取率=-265.718 25+3.278 62A+1.468 88B+4.266 05C-7.656 25×103AB-0.022 625AC-7.812 50×103BC-0.042 500A2-0.011 250B2-0.017 200C2，r2=0.954 1。

模型P<0.000 1，失拟项>0.05，说明该模型具有极显著差异，该方程的拟合度良好[19]，可信度高，可用于分析和预测氨基酸水解工艺最佳条件。

响应面设计的试验结果见表2。由表3的响应面方差分析结果可知，3个因素对氨基酸含量的影响程度不一，由大到小分别为水解温度>水解时间>盐酸浓度。盐酸浓度与水解温度之间交联影响极显著，盐酸浓度越高，溶液的沸点越低，所需要的水解温度也越低(水解过程中溶液持续沸腾的状态有利于氨基酸的水解)，当水解温度提高10 ℃时，盐酸浓度可降低至5.6～5.7 mol/L；此外，水解时间与水解温度之间交联影响极显著，当水解温度提高时，可以适当缩短水解时间，水解温度每提高10 ℃，水解时间可减少8～10 h，但强酸高温的环境很容易损害水解管密封圈和管盖。通过响应面法优化，最佳水解条件[20]为盐酸浓度5.90 mol/L、水解时间 23.41 h、水解温度114.8 ℃。结合实验室仪器精度情况，将最佳水解条件调整为盐酸浓度6.0 mol/L、水解时间23.4 h、水解温度115 ℃。该条件在验证试验中用于测定氨基酸提取率，平行测定5次，氨基酸提取率平均为6.50%，与预测值接近，且高于未优化水解条件的测定结果。因此可见，该响应面模型能较好地预测氨基酸提取率。

3 结论与讨论

本试验以GB/T 16631—2008《高效液相色谱法通则》和凯氏定氮法的测定值作为参考值， 考察茚三酮显色法对淫羊藿药渣中氨基酸定量分析的适用性与准确性，其测定结果为6.12%，介于上述2种方法测定结果之间，表明茚三酮显色法可作为淫羊藿药渣总氨基酸分析的快速简捷的化学分析方法，能准确定量分析淫羊藿药渣的总氨基酸含量。但其测定结果仍有一定偏差，分析其原因，可能是由于高效液相色谱法测定总氨基酸含量是委托贵州师范大学分析测试中心完成的，不同分析者预处理过程不一样，氨基酸水解率不同；此外，样品中的胱氨酸与半胱氨酸在强酸高温的条件下会发生氧化，本试验中考虑到胱氨酸和半胱氨酸在该样品中含量所占比例不大，且这2种氨基酸的定量分析本来就不准确[21]。因此，为进行氨基酸的快速定量分析，本试验的预处理未填充氮气。茚三酮与氨基酸产生氨反应生成有色复合物，同时茚三酮有较强氧化性，还能与样品的铵盐、联氨等还原性无机氨发生显色反应，使得检测结果偏高；此外，两者预处理脱色工艺不一样，脱色效果也不同，造成检测结果也会出现偏差。

表2 响应面设计试验结果

表3 回归方程方差分析结果

本试验对淫羊藿药渣总氨基酸水解液制备工艺进行优化，优化试验水解条件如下：盐酸浓度为6.0 mol/L，水解时间为23.4 h，水解温度为115 ℃。经验证，在该条件下，氨基酸提取率为6.50%。淫羊藿药渣作为一种可回收利用资源，提高氨基酸提取率有利于提高动植物对小分子营养成分的利用率，例如作为良好的禽畜饲料添加剂，生物工程培养菌培养液配料或食用菌栽培的生长因子等。本试验通过建立快速简捷、适宜的分析方法，定量分析淫羊藿药渣中总氨基酸成分；同时，优化其总氨基酸水解液制备工艺，用以提高淫羊藿药渣的二次利用率，为实现药渣资源的高值化利用提供参考依据。