利用异源六倍体(ArArAnAnCnCn)与甘蓝种间杂交合成甘蓝型油菜的新方法

岳 芳 汪 雷 陈燕桂 忻晓霞 李勤菲,2 梅家琴 熊志勇,* 钱 伟,*



利用异源六倍体(ArArAnAnCnCn)与甘蓝种间杂交合成甘蓝型油菜的新方法

岳 芳1,**汪 雷1,**陈燕桂1忻晓霞3李勤菲1,2梅家琴1熊志勇3,*钱 伟1,*

1西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400715;2西南大学园艺园林学院, 重庆 400715;3内蒙古大学生命科学学院, 内蒙古呼和浩特 010021

利用亲本种的遗传变异是改良油菜的重要途径, 本研究提出一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的新方法。以甘蓝型油菜(AnAnCnCn)品种中双11号为母本, 与白菜型油菜(ArAr)品系SWU07杂交, 经染色体加倍获得异源六倍体(ArArAnAnCnCn), 再与甘蓝(CoCo)杂交, 创建出具有亲本种遗传成分的新型甘蓝型油菜(ArAnCnCo)。该六倍体连续3个世代核型稳定, 各世代中的自交和自由授粉结实率无显著差异, 花粉育性在94.6%~98.8%之间, 3个世代自交平均结实率为每角果5.47粒, 自由授粉平均结实率为每角果7.93粒; 各世代六倍体(ArArAnAnCnCn)与不同类型甘蓝杂交平均结实率分别为每角果0.05、0.04、0.05粒, 世代间无显著差异, 且六倍体与栽培、野生甘蓝杂交结实性无显著差异, 可交配性不受六倍体世代及甘蓝类型的影响。尽管该六倍体与甘蓝可交配性较低, 但仍可在田间条件下成功杂交, 获得新型甘蓝型油菜(ArAnCnCo), 表明以ArArAnAnCnCn六倍体为桥梁与甘蓝杂交, 是一种有效导入甘蓝遗传成分、创建新型甘蓝型油菜的新方法。

甘蓝型油菜; 白菜型油菜; 甘蓝; 异源六倍体; 可交配性

甘蓝型油菜(, AnAnCnCn, 2= 38)是由白菜型油菜(, ArAr)与甘蓝(, CoCo)种间杂交, 染色体自然加倍而来的一种复合种[1-4]。白菜型油菜(, AA, 2= 20)作为甘蓝型油菜的亲本之一, 是一种古老的油料作物和蔬菜作物, 有着6000多年的种植史。在甘蓝型油菜引入之前, 全国范围内广泛种植白菜型油菜, 它具有含油量高、生育周期短、耐低温、耐贫瘠等特点。甘蓝(, CC, 2= 18)具有丰富的遗传多样性及许多优良的抗性特点。甘蓝型油菜的遗传资源比两个亲本种(白菜和甘蓝)狭窄[1]。利用亲本种丰富的遗传资源是拓宽和改良现有甘蓝型油菜的一个重要途径[5]。导入亲本种的遗传成分不仅能拓宽甘蓝型油菜的遗传基础, 而且能将亲本种的优良性状导入甘蓝型油菜, 提高杂种优势利用水平[6-13]。通过两个亲本种间杂交人工合成甘蓝型油菜的方法已被广泛采用[14-16]。然而, 2个亲本种的遗传距离较远, 生殖隔离较大[17], 远缘杂交存在杂种胚发育障碍, 人工合成甘蓝型油菜非常困难, 常需要经过胚挽救、染色体加倍等繁杂的过程, 其育种效率低。Ripley等[18]利用甘蓝型油菜与甘蓝杂交, 成功将甘蓝的自交不亲和性导入甘蓝型油菜。研究人员也利用白菜遗传资源来拓宽现有甘蓝型油菜遗传背景[5,7,10,19]。Zhou等[20]发现甘蓝型油菜与白菜型油菜杂交亲和性较强, 且后代中容易得到甘蓝型油菜个体。Qian等通过白菜型油菜和甘蓝型油菜杂交再与白菜杂交, 经过筛选获得了白菜基因组渗入的新型甘蓝型油菜[7,24]。但是这种方式常常需要经过多世代的回交或自交, 花费时间长, 会出现非整倍体, 且最初亲本的遗传成分易丢失[7,20]。Mei等[21]利用六倍体(AnAnCnCnCoCo)为桥梁, 成功从六倍体与油菜的BC1F2代中选育出含甘蓝抗菌核病遗传成分、抗性水平比油菜亲本显著提高且结实性良好的甘蓝型油菜。Li等[19]提出将甘蓝型油菜和甘蓝杂交, 经染色体加倍处理获得异源六倍体(AnAnCnCnCoCo), 以此为桥梁与白菜型油菜(ArAr)杂交, 获得了具有白菜遗传成分的新型甘蓝型油菜。受前人研究启发, 本研究利用六倍体(ArArAnAnCnCn)为桥梁与大量甘蓝杂交, 试图不经染色体加倍, 只通过一步杂交就将亲本种优良遗传性状导入甘蓝型油菜, 并利用甘蓝广泛的遗传资源, 改良现有甘蓝型油菜遗传背景。

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用甘蓝型油菜中双11号和白菜型油菜SWU07杂交, 经染色体加倍合成异源六倍体(ArArAnAnCnCn),再与18份栽培甘蓝及14份野生甘蓝杂交, 创建新型甘蓝型油菜(ArAnCnCo)(图1)。

1.2 试验方法

1.2.1 六倍体的创建 以甘蓝型油菜中双11号为母本, 花期剥蕾去雄, 授予白菜型油菜SWU07的花粉, 对杂种后代进行染色体加倍处理[22]。以亲本甘蓝型油菜和白菜型油菜为参照, 对加倍处理后的材料进行苗期和花期的表型考察, 并提取候选株叶片DNA, 用亲本种间存在多态性的SSR引物(表1)对杂交后代进行分子标记检测, 鉴定真假杂种; 在晴朗天气, 选取当天将要开放的未被污染的3朵花, 滴一滴1%醋酸洋红染液观察花粉育性[23]; 于初花期摘取各材料1~2 mm幼嫩花蕾, 经卡诺氏固定液处理后, 进行荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH), 观察候选六倍体的染色体数目[24]。

1.2.2 异源六倍体结实性调查及与甘蓝的可交配性检测 对鉴定出的S0代六倍体材料进行套袋自交,于收获时在自交套袋分枝和自由授粉分枝上分别从下到上连续摘取20个角果, 统计每角粒数, 调查结实性。

将鉴定后的六倍体与不同类型甘蓝正反交。正交中, 以六倍体为母本, 授以18份栽培甘蓝、14份野生甘蓝的花粉; 反交中, 将六倍体花粉授在10份栽培甘蓝及2份野生甘蓝上。统计各组合间授粉数, 套袋生长一周后去除杂交袋, 任角果自然生长, 成熟期统计角果数及所得杂交种子数, 用以衡量可交配性。结角率=存活角果数/杂交授粉数, 每角粒数=获得杂种种子总粒数/存活角果数。分别取授粉后6 h的柱头, 按照Li[19]的方法经苯胺蓝荧光染色后在荧光显微镜下观察花粉与柱头的亲和性反应。

1.3 数据分析

采用每角果粒数来衡量可交配性, 可交配性=饱满种子数/角果数; 结角率=角果数/授粉数; 对数据采用SAS version 6.07 (SAS Institute)软件进行方差分析(ANOVA)和相关性分析。

图1 新型甘蓝型油菜的育成路径

2 结果与分析

2.1 异源六倍体的获得与鉴定

甘蓝型油菜与白菜型油菜可交配性强, 二者间杂交的每角粒数平均达19粒。将这些杂种发芽成苗后经秋水仙素处理, 获得54株苗, 并移栽到大田观察苗期和花期的形态, 发现7株材料的苗期叶片形状介于双亲之间(图2-a, c, d), 花蕾花苞均大于亲本甘蓝型油菜中双11号 (图2-l, m), 初步选定为成功加倍六倍体。这7株六倍体与没加倍成功的植株相比, 具株型高大、茎秆粗壮、叶片增厚、花蕾大而饱满、花粉育性好及花粉量多等表型。

取7份染色体加倍成功材料和另外3份三倍体的花粉在体式显微镜下观察(图2-i, j)表明, 前者花粉可育率在94.6%~98.8%之间, 花粉育性均超过94%, 平均96.3%, 花粉育性表现好, 极有可能是成功加倍的六倍体。而后者育性为18.4%~31.9%, 平均育性26.5%, 育性表现低, 视为没加倍成功。据以上结果(图2-j, k), 再次将这7份视为六倍体候选材料。

观察显示, 这7份S0代六倍体候选材料的染色体均为58条, 其中40条为A染色体, 18条为C染色体(ArArAnAnCnCn)(图2-f)。

用可在2个原始亲本间呈现差异条带的7对SSR引物(表1), 对7份六倍体材料做真假杂种鉴定, 发现这7份候选材料均同时兼有双亲的遗传物质(图2-i)。

至此, 结合形态、花粉育性、染色体组成及分子标记检测, 我们最终判定这7份S0代六倍体候选材料均是成功创建的异源六倍体(ArArAnAnCnCn)。

2.2 六倍体S0、S1、S2代结实性调查

S0代六倍体的自交结实每角4.2±2.16粒, 自由授粉结实为每角8.2±2.41粒, 而没加倍成功的三倍体材料不管是自交还是自由授粉, 其结实均为每角2.0粒。这表明加倍成功的S0代六倍体表现了良好的结实性(表2)。

表1 鉴定六倍体的SSR引物

图2 人工合成六倍体的鉴别与特征

a: 六倍体S0-2; b: 新型甘蓝型油菜; c: 甘蓝型油菜中双11号; d: 白菜型油菜SWU07; e: 甘蓝(新型甘蓝型油菜的亲本); f和g分别表示六倍体S0、S1代有丝分裂中期染色体荧光原位杂交; h: 六倍体与甘蓝杂交F1代杂种染色体荧光原位杂交(红色-C基因组染色体, 蓝色为A基因组染色体; 白色-CentBr1信号, 绿色-CentBr2信号, CentBr1和CentBr2为着丝粒重复序列; C基因组特异序列探针来自BAC克隆BNIH 123L05[28]); i: 甘蓝型油菜与白菜型油菜杂交后代的分子标记鉴定结果(P1为白菜型油菜SWU07, P2为甘蓝型油菜中双11号, 引物为QW156); j和k分别为六倍体与三倍体的花粉粒染色结果, 饱满且着色深的为可育花粉粒; l和m分别为六倍体(左)与甘蓝型油菜中双11号(右)的花朵和花蕾大小比较; n: 甘蓝花粉在六倍体柱头上授粉6 h后花粉管的伸长和生长。

a: Hexaploid S0-2; b: New type; c:var. Zhongshuang 11; d:SWU07; e:the parent of the new type of; f and g display chromosome karyotype in generations S0 and S1 by FISH, respectively; h: One somatic cell from the hybrid between hexaploid andwith chromosome pattern of 20 A-genomic and 18 C-genomic chromosomes by FISH (red signals represent chromosomes from C genome, blue signals is present chromosomes from A genome, white-CentBr1, green-CentBr2, Both CentBr1, and CentBr2 are the centromere repeat sequences, C-genome specific probe comes from BAC clone BNIH123L05[28]); i: exhibits molecular patterns of the hybrid as compared with two parents (P1 meansSWU07, P2 meansZhongshuang 11, the primer is QW156); j and k show the pollen fertility of hexaploid and triploid, respectively (the full pollen with depth color means fertile pollen, others are infertile pollens); l and m show the different sizes of flowers and buds between hexaploid (right) andvar. Zhongshuang 11 (left); n: Pollen ofgrown well on the stigma at 6 h after pollination.

表2 六倍体各世代结实性调查

S0代自交获得S1代材料540粒种子。统计鉴定为六倍体的S1代材料(染色体核型鉴定图2-g)的结实性显示, 自交平均每角5.9±3.02粒, 自由授粉平均每角6.3±2.84粒, 自交结实与自由授粉结实显著正相关(< 0.05)。说明六倍体S1代具有良好的结实性, 授粉条件对结实性有显著影响, 且自交结实性好的材料其自由授粉结实性也会比较好。

S1代自交获得的300个S2代中, 鉴定是六倍体的S2代材料单株的自交结实性平均每角6.3±3.60粒, 自由授粉结实性平均每角9.3±2.62粒, 自交条件与自由授粉条件下的结实差异极显著(< 0.0001)。说明S2代六倍体结实性良好, 授粉条件对结实性影响极大。

比较发现六倍体3个世代, 随世代增加其自交结实性略有增加, 方差分析结果显示, 六倍体3个世代间的自交结实性和自然授粉均差异不显著(0.1), 但自交和自然授粉间的结实性差异极显著(= 0.01)。

2.3 异源六倍体与不同类型甘蓝间的可交配性调查

以六倍体为母本时, 三个世代六倍体共与18份栽培甘蓝、14份野生甘蓝杂交, S0代平均结实率为0.04±0.31, S1代平均结实率为0.05±0.26, S2代平均结实率为0.05±0.29; 而以甘蓝为母本的反交中, S0代平均结实率为0.06±0.25, S1代平均结实率为0.03±0.34, S2代平均结实率为0.06±0.28, 仍表现结实困难(表3)。方差分析结果显示, 六倍体与栽培、野生及不同甘蓝亚种间的结角率、结实率均无显著差异(>0.05); 表明异源六倍体(ArArAnAnCnCn)与甘蓝杂交的可交配性较低, 可交配性与甘蓝的类型、亚种及正反交方式均无关, 二者间的可交配性不受甘蓝类型及母本效应的影响。

为探索六倍体与甘蓝可交配性低的原因, 本研究观察甘蓝花粉粒在六倍体(ArArAnAnCnCn)柱头上的识别反应, 取授粉后6 h的柱头, 发现(图2-n)大量的花粉管萌发, 花粉与柱头正常识别, 花粉管正常伸长; 观察后期胚珠形态发育发现, 在8 d时可看到饱满的胚珠, 到16 d时出现了大量的败育, 原来饱满的胚珠开始干瘪变小, 但仍可看到有个别存活, 说明六倍体与甘蓝能正常受精, 杂交结实困难是由受精后障碍引起。

表3 六倍体与甘蓝的可交配性

2.4 新型甘蓝型油菜的鉴定

对上述异源六倍体与甘蓝杂交获得的151份杂交后代的田间表型观察发现, 苗期表型趋于两亲本之间, 叶形遗传了母本的褶皱特征, 同时遗传了甘蓝的叶质厚、无光泽、有波形齿叶, 叶色深绿等特征, 且花期均早于两亲本, 晚于中双11号。取F1杂交种发芽1~2 d后的根尖用FISH方法鉴定染色体数目, 通过对杂种体细胞学分析, 观察到杂种根尖有丝分裂中期染色体组成(图2-h), 带有红色信号的是C基因组染色体, 蓝色(DAPI染色)为来自A基因组染色体, 杂种的染色体为38条(20A+18C), 因此鉴定F1是真杂种, 即新合成的甘蓝型油菜(ArAnCnCo)(图2-b), 说明利用六倍体与甘蓝杂交能获得新型甘蓝型油菜。本研究中六倍体与甘蓝的结实性虽较低, 但一旦杂交成功就可直接获得兼有白菜、甘蓝基因型的丰富的遗传基础, 从新的途径缩短了新型甘蓝型油菜的育种年限。

3 讨论

3.1 远缘杂交

长期定向选择, 容易导致物种的遗传资源丰富性降低[25]。远缘杂交则通过不同物种之间的杂交可以实现有利基因的转移, 得到新基因和特异性状, 是作物品种改良的重要途径, 如雄性不育系的创建、植物抗病性和抗寒性的提高、杂种优势的利用等[26]。但远缘杂交也伴随着亲和性障碍, 分为受精前及受精后的障碍, 前者表现为花粉与柱头无法正常识别及生长, 难以完成受精; 后者则出现受精后幼胚不发育或中途停止发育、幼胚畸形、F1植株生长不正常及F1植株不能产生正常雌雄配子[27]。本研究通过大量的甘蓝与六倍体(ArArAnAnCnCn)相互杂交发现甘蓝的花粉粒可在六倍体柱头上正常生长发育, 但胚珠却在后期停止生长, 最终败育死亡, 说明异源六倍体(ArArAnAnCnCn)与甘蓝杂交具受精后亲和性障碍。

3.2 甘蓝型油菜亲本种的利用途径

甘蓝型油菜起源于400多年前, 是由白菜型油菜与甘蓝自然杂交后二倍化进化来的复合种。亲本种丰富的遗传资源可扩大甘蓝型油菜的遗传背景[1,28-32],但人工合成的甘蓝型油菜因生殖隔离障碍败育严重。殷家明试验发现, 在田间条件下白菜型油菜与羽衣甘蓝的杂种得率为每100子房0粒, 而借助子房培养杂种得率为每100子房5粒[33]。张国庆等[34]同样通过胚挽救技术获得了由白菜型油菜与甘蓝杂交合成的甘蓝型油菜单倍体。相对这些研究而言, 本试验提供一个捷径的方法, 以ArArAnAnCnCn六倍体为桥梁与不同的甘蓝杂交, 常规杂交获得杂种率为每100子房5粒, 结实性远高于白菜和甘蓝, 且不需要胚挽救及染色体加倍, 在田间条件下通过一步杂交就可将甘蓝丰富的遗传成分导入新型甘蓝型油菜, 达到了扩大甘蓝型油菜遗传背景和拓宽种质资源的目的, 缩短了育种时间, 减少了培育工作量。通过异源六倍体(ArArAnAnCnCn)途径合成新型甘蓝型油菜的策略可以运用到今后的育种实践中。

3.3 异源六倍体自交结实性及与甘蓝的可交配性

对六倍体S0、S1和S2结实性统计发现, 3个世代平均自交结实率和天然结实率分别为每角5.47粒和7.93粒, 结实性没有显著性差异, 但随着世代的增加, 结实率有微量提高。六倍体自交后代结实性的变化, 可能由于多倍体株系总是具有多倍体之间染色体配对不协调的问题, 而自交后, 少数比较协调的可以最终形成种子, 在这个过程中, 雌雄配子之间更加协调, 有利于结实率的提高, 而且随着自交代数的增加, 结实率有一个上升的趋势[35]。

本研究中六倍体与甘蓝的可交配性并不是很好, 百份杂交最终才能收获几粒种子。在白菜和甘蓝杂交及甘蓝型油菜与甘蓝杂交中均发现可交配性低的现象[10,33], 可能甘蓝基因组中存在抑制远缘杂交杂种胚发育的基因, 有待进一步探索。

4 结论

以甘蓝型油菜与白菜型油菜合成的异源六倍体(ArArAnAnCnCn)为桥梁, 与甘蓝(CoCo)杂交, 在田间条件下, 不经染色体加倍就可直接获得具有甘蓝遗传成分的新型甘蓝型油菜, 二者可交配性虽较低, 但比甘白杂交的效率高。有望通过该技术途径创建新型甘蓝型油菜, 实现用亲本丰富的遗传变异拓展甘蓝型油菜遗传资源的目的。

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A new method of synthesizingby crossingwith the allohexaploid derived from hybrid betweenand

YUE Fang1,**, WANG Lei1,**, CHEN Yan-Gui1, XIN Xiao-Xia3, LI Qin-Fei1,2, MEI Jia-Qin1, XIONG Zhi-Yong3,*, and QIAN Wei1,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing, 400715, China;2College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China;3College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, Inner Mongolia, China

It is an important way to improve(AnAnCnCn) try using its parental species. Here a hexaploid method was proposed to synthesizeby crossing(CoCo) with the hexaploid derived from the interspecific hybridization betweenand. The hexaploid (ArArAnAnCnCn) was developed by crossingcv. ‘Zhongshuang 11’ withcv. ‘SWU07’, and followed by chromosome doubling. And the hexaploid was crossed with various types ofto develop new type. The hexaploid exhibited stable karyotype in three successive generations. There was no significant difference for seed setting rate between open-pollination and selfing-pollination in generations. The pollen fertility ranged from 94.6% to 98.8%. The average seed-setting rate was 5.47 and 7.93 seeds per pod for the open-pollination and selfing-pollination in three successive generations, respectively. The average crossability was 0.05, 0.04, and 0.05 seeds per pod in three successive crossing generations between the hexaploid and, respectively. There was no significant difference in pod setting rate and seed setting rate among the hybrids between the hexaploid and the diverse types ofoleracea. A few seeds were obtained by crossingwith hexaploid ArArAnAnCnCnin the field, suggesting that the method of hexaploid is useful to introgress the genomic components of parental species into.

;;; allohexaploid; crossability

2018-04-16;

2018-10-08;

2018-11-09.

10.3724/SP.J.1006.2019.84055

熊志勇, E-mail: xiongzy2003@aliyun.com; 钱伟, E-mail: qianwei666@hotmail.com

岳芳, E-mail: 675785344@qq.com**同等贡献(Contributed equally to this work)

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2015CB150201), 国家自然科学基金项目(31471173)和重庆市社会事业与民生保障科技创新专项(cstc2016shmszx80074)资助。

This study was supported by the National Basic Research Program of China (973 Program) (2015CB150201), the National Natural Science Foundation of China (31471173), and the Project of Chongqing Science and Technology Commission Grants (cstc2016shmszx80074).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181108.0917.002.html