构树再生体系的建立及防褐变研究

武玉婷 石岭 张建中

摘要：以构树茎段为外植体，探究构树再生体系中生长调节剂组合以及再生过程抗褐变剂种类和浓度对构树再生的影响，结果表明，适宜构树启动培养基配方为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，构树初代最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L。添加0.1 g/L抗坏血酸对构树抗褐变效果最好，构树继代最适培养基配方为MS+IBA 0.1 mg/L+CPPU 1.0 mg/L+维生素C 0.1 mg/L。

关键词：构树;初代培养;褐变研究;继代培养

中图分类号： S792.990.5  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）22-0061-04

构树[Broussonetia papeyrifera（L.） Vent]又名褚树、谷浆树、野杨梅子等，属被子植物门双子叶植物纲，荨麻目[1]桑科（Moreceae）构树属（Broussonetia）多年生落叶乔木或灌木[2]，古称“穀树”，古幽州人称“桑穀”[3]。构树的叶、枝、皮、根皮、果实等都可以作药用，构树皮被广泛用于制造礼品包装纸、书画纸等各种高档纸型[4]，构树果实含有丰富的营养物质，如氨基酸、糖类、矿物元素等[5]，具有抗氧化、美容、健身、缓解疲劳、提高人体免疫力等功能[6-7]，果实可生食和酿酒，有补肾、壮筋骨、健胃消肿之功效[8-9]。

褐变是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，从组织表面向培养基释放分泌物质，氧化后使培养基逐渐变成褐色（或黑色），從而使外植体进一步变褐而死亡的现象[10-13]。影响褐变的主要因素有暗培养、培养基种类、培养基状态、组成、生长调节物质及组合等[14-16]。除此之外，可向培养基中加入一些化学添加剂如吸附剂[活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）[17]]、抗氧化剂[维生素C、柠檬酸、半胱氨酸（Cys）]及其盐酸盐、谷胱甘肽、硫代硫酸钠、二硫苏糖醇等[18]。

构树在自然条件下生长周期较长，满足不了社会的需求，近几年来，构树组培快繁技术发展较快，但对于构树组培研究的资料较少，主要集中在构树增殖方面，而对于构树组织培养过程中发生的褐变现象目前还鲜有研究。因此，以构树茎段为外植体，利用组织培养快速繁殖技术，对构树增殖过程以及抗褐变条件进行系统研究，从而进行大量扩繁，以期解决构树种苗大量需求的问题，为造纸、饲料等相关产业提供充足的苗木来源，在生产实践及理论研究上具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采自内蒙古武川县宝坤农业园区内生长旺盛的构树嫩茎作为试验材料，采集时间为2017年6月，在内蒙古农业大学新区实验室进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 启动培养 以MS+6-BA 1.0 mg/L为基础培养基，添加不同浓度NAA（0.1、1.0 mg/L）和IBA（0.1、1.0 mg/L）组合共4个处理，接种1个/瓶，每个处理10瓶，3次重复，30 d后统计数据。

1.2.2 初代培养 以MS培养基上添加不同浓度6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和IBA（0.1、0.2、0.5 mg/L）组合共9个处理，接种1个/瓶，每个处理10瓶，重复3次，30 d后统计数据。

1.2.3 褐变控制研究 以MS为基础培养基，添加不同浓度活性炭（0.50、1.00、1.50 g/L）、抗坏血酸（0.10、0.50、1.00 g/L）和半胱氨酸（0.10、0.50、1.00 g/L），接种1个/瓶，每个处理10瓶，重复3次，30 d后统计褐变率、褐变等级。

1.2.4 继代培养 以MS+0.1 g/L维生素C为基本培养基，分别添加不同浓度细胞分裂素如6-BA、CPPU、生长素如NAA、IBA等，接种1个/瓶，每个处理10瓶，重复3次，30 d后统计数据。

1.3 培养条件

培养温度为25 ℃，在GTOP-280B光照培养箱中培养，光照度为2 000 lx，光照时数为12 h/d。

2 结果与分析

2.1 启动培养

由表1可知，A3处理的平均株高、分化率和增殖倍数均高于其他3个处理，且显著高于A2和A4处理，但与A1处理无显著性差异，A2和A4处理之间差异性不显著，A3处理极显著高于A2和A4处理。从试管苗生长状态来看，A3与A1处理试管苗生长旺盛，分化率高，而A2处理下的试管苗分化植株较少，且试管苗生长缓慢，叶片较小，生长较弱。

2.2 初代培养

由表2可知，B5试管苗分化率最高，达到97%，B6和B8处理平均株高均在2.70 cm及以上，高于其他处理，各处理平均株高均在2.51～2.71 cm之间。增殖倍数显著性差异分析结果显示，B5、B6、B7和B8处理之间不存在显著差异，B1～B4处理之间不存在显著差异但都显著低于B5处理;B5～B9处理之间差异不显著，B5处理与B1～B4处理存在极显著差异。从试管苗生长状态来看，B5、B6处理下叶片颜色深绿，叶大而平展，植株生长发育良好，长势旺;B6～B9处理下植株生长健壮;B1和B3处理下分化的植株少，植株矮小，生长缓慢，出现黄叶，少量植株因褐变死亡。

2.3 褐变控制研究

根据表3不同抗褐变剂对构树褐变的影响显著性差异结果分析可知，C3和C6处理褐变程度差异不显著但显著低于其他7个处理，C1、C4和C7处理之间不存在显著差异，C2、C5、C8和C9处理之间差异不显著;C1、C4和C7处理褐变度极显著高于C3、C6和C9处理，C3、C6和C9处理抗褐变效果较好。

根据图1分析可知，构树褐变程度随着抗褐变剂活性炭、维生素C以及半胱氨酸浓度的增加而降低，活性炭抗褐变效果强于其他2种抗褐变剂，但加入活性炭的构树试管苗虽然叶片大而绿，但随着培养时间的增加而出现枝条细软、叶片下垂的现象，长势越来越弱，影响增殖效果，因此在增殖阶段不适合添加活性炭;在各个浓度下维生素C抗褐变效果均强于半胱氨酸，当维生素C浓度为0.1 g/L时，试管苗生长健壮并可以继续增殖，但随着维生素C和半胱氨酸浓度的增加，构树试管苗均出现叶片发黄甚至死亡的现象，综合考虑，最适宜的抗褐变剂为维生素C且浓度为0.1 g/L。

2.4 继代培养

2.4.1 细胞分裂素种类和浓度对构树增殖的影响 由表4可知，随着6-BA浓度的增加，试管苗分化率和增殖倍数均增加;随着CPPU浓度增加，试管苗的平均株高、分化率和增殖倍数呈增加趋势;D6处理下构树无菌苗平均株高最大，为2.75 cm，D3处理下无菌苗分化率达100%。增殖倍数显著性差异分析结果显示，在显著水平为0.05水平时，D6处理显著高于其他5个处理，D4处理下增殖倍数最小，显著低于其他5个处理，D1和D5之间不存在显著差异;在显著水平為0.01水平时，D6处理极显著高于其他处理，D4极显著低于其他处理，D1、D2和D5之间差异不显著，添加1 mg/L CPPU的试管苗平均株高和增殖倍数均高于其他组合，因此CPPU是最适宜试管苗增殖的细胞分裂素。

2.4.2 生长素种类和浓度对构树增殖的影响 由表5分析可知，D12处理下试管苗分化率达到100%。增殖倍数显著性差异分析结果显示，在显著水平为0.05水平时，D10和D12处理显著高于D7～D9处理，二者之间差异性不显著，D7、D8、D9和D11处理之间差异不显著，在显著水平为0.01水平时，D7、D10、D11和D12处理无显著差异。从株高、分化率和增殖倍数综合考虑，添加NAA的处理对构树的作用效果好于IBA。

2.4.3 CPPU和IBA不同浓度组合对构树增殖的影响 由表6分析可知，当IBA浓度为0.1 mg/L时，试管苗增殖倍数先升高后降低又略升高，D14处理试管苗分化率达到100%，平均株高3.11 cm;IBA浓度为0.2 mg/L时，试管苗分化率和增殖倍数均为先增加后减少。增殖倍数显著性差异分析结果显示，在显著水平为0.05水平时，D14和D16处理显著高于其他处理，D13、D15、D16、D17和D18之间差异不显著;在显著水平为0.01水平时，D14与D13、D17、D19和D20差异极显著，与D15、D16和D18之间差异不显著。当IBA为 0.1 mg/L、CPPU为1.0 mg/L时，试管苗分化率、增殖倍数最大，分别为100%、4.33。

3 结论与讨论

3.1 启动培养

通过对构树进行不同浓度NAA和IBA处理，结果显示，NAA和IBA对构树的生长均有促进作用，这一作用会因各激素浓度不同而作用不同，IBA处理效果总体高于NAA，且浓度为0.1 mg/L的NAA和IBA处理效果强于浓度为 1.0 mg/L，这与万文报道的高浓度生长素会使得杂交构树组培苗的分化率下降研究结果[19]相一致，通过初代培养，筛选出了最适宜构树启动培养的培养基配方，为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L。

3.2 初代培养

通过研究6-BA和IBA 2种生长调节剂对构树初代培养的影响，结果表明，适当浓度的6-BA和IBA组合对构树生长和增殖有促进作用。各处理之间增殖倍数显著性差异分析结果显示，当6-BA浓度为1.0 mg/L时，IBA浓度为0.2、0.5 mg/L，构树试管苗增殖效果显著，增殖倍数较高，分别为3.33、3.03，二者无显著差异，试管苗生长状况良好，叶绿，长势旺盛，因此可得出构树初代培养最适培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L。

3.3 褐变控制研究

在植物组织培养过程中，木本植物均存在着不同程度的褐变现象。添加抗褐变剂可有效防止褐变，本试验研究了不同抗褐变剂以及不同浓度对构树褐变的影响，选用活性炭（活性炭）、维生素C和半胱氨酸（Cys）3种抗褐变剂，试验证明，随着抗褐变剂浓度的增加，构树试管苗褐变程度逐渐减轻，但高浓度抗褐变剂会对构树生长造成影响。何琼英等研究表明，维生素C对褐变的控制作用是有消耗性的，所以用维生素C作抗褐变添加物时，应适当减短转接时间[20];活性炭的防褐变效果虽然好，但会吸附培养基中其他营养物质，对组培苗的生长造成一定的影响[18];半胱氨酸与醌类物质醌结合，能抑制多酚氧化酶活性[21]，因此可抑制组培苗褐变发生，当维生素C浓度为0.1 g/L时，防褐变效果最佳。

3.4 继代培养

通过对构树继代培养的研究可知，生长素类的IBA和NAA对构树增殖均有促进作用，但NAA作用效果好于IBA，这与初代培养中的结果存在差异，可能是由于二者浓度不同所造成的，须进一步探索;在培养基中添加CPPU试管苗的平均株高、分化率和增殖倍数普遍强于6-BA，有研究证明CPPU诱导桑树下胚轴分化新梢的效果显著好于BA[22]，这与本试验结果一致。CPPU是近年来从苯脲衍生物中筛选出一种廉价细胞分裂素类物质，具有促进细胞分裂的作用[23]。本试验中CPPU的作用效果主要表现在促进植株伸长以及侧芽分化，且CPPU浓度越高，作用效果越明显，但高浓度CPPU虽然对构树株高有良好的促进作用，但会抑制构树叶片生长，造成构树叶片色浅、叶面积小、长势较弱，所以使用CPPU浓度不宜太高。当IBA浓度为0.1 mg/L、CPPU浓度为 1.0 mg/L 时，试管苗平均株高3.11 cm，分化率100%，增殖倍数3.33，是继代培养中效果最好的处理，因此，MS+IBA 01 mg/L+CPPU 1.0 mg/L+维生素C 0.1 mg/L为构树继代培养最佳配方。

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