采用液质联用技术分析灵芝孢子粉提取物中的三萜类化合物

李福森 郝建宇 王晶

摘要：以灵芝孢子粉为研究对象，通过高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，简称HPLC）考察不同溶剂对其三萜类化合物的提取效果。应用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）快速对灵芝孢子粉中的三萜类化合物进行初步鉴定。应用超声提取法，分别以甲醇、95%乙醇和异丙醇为提取溶剂对灵芝孢子粉中三萜类化合物进行提取，以HPLC分析提取物，考察不同溶剂对有效成分的影响。采用LC-MS技术对提取物进行分析，对三萜类化合物进行快速鉴定。结果表明，通过HPLC对3种不同溶剂提取物进行分析，确定异丙醇为灵芝孢子粉中活性成分最佳的提取溶剂。应用LC-MS技术对提取物进行分析，与相关文献进行比对，对其中15种三萜类化合物进行快速鉴定。结果表明，异丙醇适合于灵芝孢子粉中三萜类化合物的提取，提取物中含有多种三萜类化合物，LC-MS能够快速对提取物中的化合物进行快速的结构鉴定。

关键词：灵芝孢子粉;三萜;高效液相色谱;LC-ESI-MS

中图分类号：R284.1   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）22-0230-04

灵芝（Ganoderma lucidum）别称仙草，珍贵的药用真菌，属担子菌纲，多孔菌科，灵芝属。灵芝在我国有2 000多年的药用历史，根据《神农本草经》记载，灵芝具有补中益气、扶正固本、等功效[1]。灵芝传统药用部位是子实体，但灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的淡雾状的极其微小的孢子，具有灵芝的遗传活性物质[2]。近年来，灵芝孢子粉作为灵芝的又一药用部位逐渐被认识和接收。经现代药理验证，灵芝孢子粉具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、抗炎、保肝、降血脂、降血压、降血糖、抗缺氧能力、神经系统调节等功效[3-4]。

国内外学者从上世纪80年代开始深入研究灵芝的化学成分，迄今为止，已分离出200多种化合物[5]。灵芝孢子粉中的药效成分主要是灵芝多糖、肽类、三萜类、腺嘌呤核苷、硒元素等成分，其中，三萜类化合物是其中的主要药效成分之一。目前，三萜类化合物仍然未被充分开发利用，主要原因是天然存在的三萜类化合物含量较少，大多数不能被人工合成[6]。因此，研究灵芝孢子粉三萜化合物具有重要的现实意义。

以灵芝孢子粉中三萜类化合物为研究对象，考察不同溶剂对有效成分提取效果的影响，并应用液相质谱联用技术对其中的成分进行快速的分析和鉴定，以期为灵芝孢子粉这一药用资源的研究开发提供试验依据。

1 试验方法

1.1 材料与仪器

灵芝孢子粉由吉林省宝源东北特产经销处提供，长春师范大学中心实验室鉴定为多孔菌科药用真菌灵芝（Ganoderma lucidum）所产生的孢子粉;甲醇、醋酸等用于色谱分析的试剂均为色谱纯（加拿大Caledon LaboratoriesL Ltd.公司）;乙醇、异丙醇等用于提取试剂均为分析纯（北京精细化学品有限公司）。

主要仪器有0.45 μm滤膜（美国安捷伦公司）、1100 Series HPLC高效液相色谱（美国安捷伦公司）;S180H超声清洗器（德国Elma公司）、BS 124S电子天平（德国Sartorius AG）、Thermo LCQ Fleet离子阱LC-MS联用仪（美国Thermo公司）。

1.2 样品提取

精确称取1.006 3 g灵芝孢子粉，50 mL甲醇浸泡24 h，超声提取90 min，过滤蒸干后加2 mL色谱甲醇溶解，提取物放入4 ℃冰箱中保存，待检测。

精确称取1.337 5 g灵芝孢子粉，50 mL 95%乙醇浸泡 24 h，超声提取90 min，过滤蒸干后加2 mL色譜甲醇溶解，提取物放入4 ℃冰箱中保存，待测。

精确称取1.006 6 g灵芝孢子粉，50 mL异丙醇溶解，超声提取90 min，蒸干后加2 mL色谱甲醇溶解，提取物放入 4 ℃ 冰箱中保存，待测。

1.3 HPLC分析条件

高效液相色谱为Agilent 1100，配备四元洗脱泵，脱气阀，自动进样器，二极管阵列检测器（diode-array detector，简称DAD），柱温箱（Agilent 1200），色谱柱为Agilent-extend C18 （250×4.6 mm，5 μm）。流动相为甲醇（A）和0.5%乙酸水溶液（B），所用溶剂经0.45 μm滤膜过滤;流速为1.0 mL/min，运行时间为30 min，进样量为10 μL，检测波长252 nm。HPCL洗脱梯度如下表1。

1.4 LC-MS分析条件

利用电喷雾离子阱质谱研究灵芝孢子粉粗提物的三萜类化合物，在负离子模式进行分析。液相色谱（liquid chromatography，简称LC）分析条件：色谱柱为Agilent-extend C18 （250×4.6 mm，5 μm）;流动相为乙腈（A）和0.5%乙酸水溶液（B），洗脱梯度如表2所示;进样量为10 μL;检测波长252 nm。MS分析条件：负离子模式，鞘气（N2）流速40 arb（arbitrary unit），辅助气（N2）流速10 arb;毛细管电压为 3.5 kV;毛细管温度为350 ℃;透镜电压为110 V。

2 结果与讨论

2.1 通过HPLC确定最佳提取溶剂

采用甲醇、95%乙醇、异丙醇等3种溶剂对灵芝孢子粉进行提取，将灵芝孢子粉的提取物应用HPLC-DAD进行分析，得到不同溶剂提取物的色谱（图1），其中，95%乙醇提取物与甲醇提取物的色谱图基本一致，因此，选择甲醇提取物的谱图为代表。

由图1可知，以甲醇作为提取溶剂得到谱图的溶剂峰较高，说明提取物中极性大的杂质较多，而在之后的梯度洗脱过程中没有出现显著的色谱图，说明提取物中三萜类化合物含量较低;而以异丙醇作提取溶剂，得到的谱图中溶剂峰明显降低，说明提取物中的极性杂质含量减少，但在洗脱过程中也出现多个色谱峰，说明以异丙醇为溶剂，对灵芝孢子粉中的三萜类化合物提取效果较好。

2.2 應用LC-MS联用仪分析灵芝孢子粉中有效成分

以异丙醇溶液作为提取溶剂，提取灵芝孢子分中有效成分，并应用LC-MS法对灵芝孢子粉中有效成分进行分析，得到LC-MS谱图（图2）。

通过优化液相和色谱的分析条件，对灵芝孢子粉的提取物进行了分析，对数据进行整理， 并与文献[6-19]进行对比，对其中15个主要的化合物进行了初步定性分析。在图2-B中，主要的[M-H]-离子峰分别为m/z 454、458、474、476、502、502、508、512、514、528、528、528、528、528、570的化合物进行多级串联质谱研究，相应化合物的分子量分别为455、459、475、477、503、503、509、513、515、529、529、529、529、529、571 u。通过整理质谱所提供的数据，根据化合物的洗脱顺序、保留时间、分子量、质谱信息，得到可能的分子式以及初步鉴定结果见表3。

采用LC-MS技术分析得到数据，查阅文献对其进行分析，对主要的活性成分进行了初步鉴定，根据文献[9]报道，目前已知的灵芝孢子粉中三萜类化合物的母核可归类为5种（图3）。LC-MS的试验结果表明，从灵芝孢子粉的异丙醇提取物中初步鉴别了15种有效成分，其中的三萜类化合物的结构都属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物，其中所含的碳原子分为C30、C27和C24等3大类，在三萜酸的结构中，环上的双键大多位于Δ8（9）大部分在C11位和C23位有羧基，而且在C3、C7、C15位也有被羧基或羟基所取代。而在三萜醇、醛和过氧化物的结构中，环大多存在2个不饱和双键，其位置在Δ7（8）Δ9（11）位，C11位和C23位不存在羰基，而且环上取代基明显减少。

3 结论

采用超声提取法，分别以甲醇、95%乙醇、异丙醇为溶剂对灵芝孢子粉中三萜类化合物进行提取，应用HPLC法对提取物进行分析，通过对色谱结果进行对比，甲醇和95%乙醇提取物的色谱图相似，其中溶剂峰较高，极性杂质含量多，三萜类化合物含量较低;异丙醇的色谱图中溶剂峰明显降低，极性杂质少，确定最佳提取溶剂为异丙醇。应用LC-MS联用技术对灵芝孢子粉中有效成分进行分析，最后通过与相关文献对比， 初步从提取物中确定了灵芝孢子粉中含有灵芝醇I、

赤芝酸J甲脂、灵芝酸C、赤芝酸C、灵芝酸V、赤芝酸D、灵芝酸Mf等15种三萜类化合物。

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