桂林市售（用）腌菜亚硝酸盐含量及其细菌丰富度检测

◎ 陈玉怡，廖英琛，廖 睿，严金琳，陆祖军

（广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541006）

腌菜历来是我国居民喜爱的配菜和开胃品。随着对腌菜抗菌、抗癌、抗衰老以及减肥等保健功能的认识[1]，腌菜产业飞速发展，形成了“小产品、大市场”的格局[2]。腌菜一般采用自然厌氧发酵生产，产品的亚硝酸盐含量、微生物种类组成和丰度成为腌菜质量的重要指标，也是消费者、学者的关注点。生书晶报道韩国泡菜中的乳酸菌达30多种[3]。张宗舟等对泡菜生产过程中的微生物进行区系分析，证实泡菜发酵是一种特殊的混菌共酵，乳酸菌、醋酸菌起主要作用，丁酸菌、酵母菌起辅助作用[4]。

桂林市地处东经 109°36′50″～ 111°29′30″，北纬24°15′23″～ 26°23′30″，属亚热带季风气候。当地居民尤其偏爱作为腌菜，市售产品主要由当地厂家、作坊生产，但至今尚无桂林市售腌菜产品的安全质量状态研究和报道。本项目用盐酸萘乙二胺分光光度法测定桂林市售腌菜产品的亚硝酸盐含量，以高通量测序法对其细菌多样性进行系统分析，旨在为桂林在售（用）腌菜的安全性评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

以包装方式（袋装、罐装、散装）为样品选取主依据，各目标包装方式下随机选取6种产品共18个样品（见表1）。对全部样品进行亚硝酸盐测定，用高通量测序技术检测9个样品的细菌及丰度。

表1 酱腌菜样品基础信息表

1.2 亚硝酸盐含量测定

1.2.1 试剂

饱和硼砂溶液；106 g·L-1亚铁氰化钾水溶液；磺胺溶液（磺胺1 g+25 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释至100 mL）；萘胺溶液（0.1 g萘胺+0.5 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释至50 mL）；220 g·L-1乙酸锌水溶液

1.2.2 仪器和设备

TU-1810SPC 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；YP5002 电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2.3 步骤

检测步骤参照国家标准（GB 5009.33-2016）[5]。

取50 g样品，加蒸馏水至200 mL，匀浆；取50 mL匀浆，用80 ℃的温水洗入250 mL锥形瓶，加入6.5 mL饱和硼砂溶液，摇匀；沸水浴30 min，取出锥形瓶置于冷水中冷却至室温；加1 g碳粉，2 mL亚铁氰化钾溶液，2 mL乙酸锌于锥形瓶中，振摇3～5 min，调节pH1～2，用二次蒸馏水定容至250 mL，摇匀；分装到3支胶管中离心（2 500 r·min-1，10min）；取3支试管分别加入2 mL样液上清，4 mL磺胺，摇匀后放置5 min，加入4 mL萘胺；反应30 min，于520 nm处进行紫外分光光度测定；每个样品同时测定3份，结果用“平均值±标准差”表示。

1.3 细菌种类多样性及其丰度测定

选取18个样品中的9个样品进行高通量测序。提取样品总DNA后，将细菌16 S rDNA （V3+V4）区域 引 物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'、806R：5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3） 末 端 加上测序接头，进行PCR扩增，并对其产物进行纯化、定量和均一化，形成测序文库。测序文库质量检测合格后用Illumina HiSeq 2500进行测序。

2 结果与分析

2.1 腌菜亚硝酸盐含量测定结果

18个腌菜样品中亚硝酸盐含量测定结果见表2。

表2 18个样品亚硝酸盐含量及其含水量表

由表2可知，散装样品的亚硝酸盐含量平均值最低，其次是袋装，最高者为罐装。罐装的酱香木瓜（G06）亚硝酸盐含量为（25.67±0.56）mg·kg-1，超过了国家酱腌菜食品安全标准20 mg·kg-1。

2.2 细菌多样性

2.2.1 UPGMA分析

Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean是一种常用非加权组平均聚类分析方法，可为样品层次聚类，结果如图1、图2。

图1 非加权组平均聚类图

图2 加权组平均聚类图

图1的分析结果显示，在不同时考察物种有无及丰度时，同种包装的细菌物种的类型相似。在同时考察物种有无和丰度时（图2），散装腌菜的细菌物种的类型相似性没有变化，罐装与袋装者的细菌物种类型发生了变化。

2.2.2 样品各分类等级物种统计分析

表3为样品各分类等级物种统计表，显示了9个腌菜样品细菌各分类等级物种类型数目。

表3 样品各等级物种统计表

除界、门之外的其他5个层级，袋装样品所含细菌种类数量最多，罐装次之，散装样品最少。

2.2.3 物种分布

图3、4分别为样品细菌群落属、门水平物种分布比例。一种颜色代表一个物种，色块长度表示物种所占相对丰度比例；为使视图效果最佳，只显示丰度水平前十的物种，并将其他物种合并为 Others 在图中显示，Unclassified代表未得到分类学注释的物种。

图3 属水平物种分布图

图 4 门水平物种分布图

在属水平上（图3），检测的9个腌菜样品的优势微生物为乳杆菌属（Lactobacillus）、不动杆菌属（Acinctobacter）、弓（形）杆菌属（Arcobacter）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、克雷伯菌属（Klebsiella）、酸杆菌属（Acctobacter）、大肠杆菌志贺菌（Escherichia-Shigella）和假单胞菌属（Pseudomonas）。以蔬菜食材、食盐、饮用水为主要材料的腌菜（罐装品味鲜老坛豇豆（G03）、袋装邓仕鱼酸菜（D03）、散装的酸笋（S01）和酸菜（S03））其乳酸菌属占69.24%～97.89%。散装藠头（S02）细菌种类最多，达9类。从门水平（图4）看，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）是检测的9个样品中优势菌群，它们为好氧或兼性细菌。

2.2.4 样品亚硝酸盐含量与其细菌物种丰富度相关性

Alpha多样性反映的是单个样品物种丰富度及物种多样性；Chao1和Ace指数衡量物种丰富度即物种数量的多少；Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性受样品群落中物种丰富度和物种均匀度的影响，Shannon指数越大，Simpson指数越小，说明样品的物种多样性越高。OTU的覆盖率反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况，覆盖率越高，则样本中物种被测出的概率越高。本项目使用Mothur（version v.1.30）软件进行样品的Alpha多样性指数统计和评估，结果如表4。

表4 AIpha多样性指数与样品亚硝酸盐含量的比较表

将表中的样品亚硝酸盐含量（干重）与Simpson指数进行相关性分析，其相关系数为0.554 7，呈正相关关系，随着样品亚硝酸盐含量增加，其细菌多样性的降低（如表5）。

表5 AIpha多样性指数值与样品亚硝酸盐含量相关性分析表

3 讨论

3.1 亚硝酸含量分析

国家标准（GB 5009.33-2016）规定，酱腌菜的亚硝酸盐含量不得超过20 mg·kg-1（湿重）。所检测的桂林市在售（用）18个腌菜产品中只有罐装木瓜（G06）的亚硝酸盐含量为（25.67±0.56）mg·kg-1（湿重），超标28.4%，超标样品是样品总数的5.56%。新疆维吾尔自治区食品药品监督检验所检测的萝卜和白菜两类泡菜14个样品中有9个样品的亚硝酸盐含量超标，超标率为64.3%[6]；兰州市、白银市、通渭市的198份酱腌菜超标率为5.56%[7]。江苏省沭阳县市场销售散装、袋装的4个盐腌菜产品共423份发现超标率为4.26%[8]。从亚硝酸含量角度，桂林市在售（用）腌菜还是相对比较安全的。

亚硝酸盐的积累是泡菜生产及储备过程中的常见问题。本研究中不同包装类型的腌菜亚硝酸盐含量不同，散装者平均值最低，其次是袋装，最高者为罐装。此可能与其制备、出售时的密封程度及产品内硝化菌等好氧菌丰度有关，因为溶解氧浓度与硝化酶（由硝化菌等好氧菌产生）活性对亚硝酸降解起决定作用[9]；但本研究中硝化菌并不是是任何一个样品的优势菌群，证明研究对象在制备过程及货架期内满足厌氧条件（密闭性），或有氧条件（对于散装腌菜）是短暂的。厚壁菌门的乳酸菌类群代谢过程中产生乳酸引起低pH值，在亚硝酸盐酸降解过程中起关键作用[10]。因此本研究中不同包装腌菜的亚硝酸盐含量（湿重）差异，可与乳酸菌群及其厌氧产酸量（或者浓度）有关。

3.2 细菌多样性分析

随机抽取18个样品中的9个，进行高通量测序，检测其中细菌多样性，结果显示，除界、门之外的其他5个层级，袋装样品所含细菌种类数量最多，罐装次之，散装样品最少，是否与产品生产过程及包装方式的无氧程度及无氧时间长短有关，有待进一步研究。散装腌菜为当地工厂或作坊生产，一直处于完全浸泡状态，售出时点离出厂时点不超过6 h，有的甚至是出售时仍处于厌氧发酵条件，因此受杂菌污染的概率较低。

3.3 食材对细菌丰富度的影响分析

本研究对象中厚壁菌门、变形菌门为优势门。除了藠头（S02，石蒜科植物），以其他食材制备的腌菜乳酸菌属占69.24%～97.89%，以禾本科和十字花科植物（如竹笋、芥菜）为发酵底物者，乳酸菌属占比最高。乳酸菌厌氧条件下发酵产酸抑制非耐酸菌群如许多致病菌和腐败菌的生长，是腌菜保质、提高风味的重要因素[11]。禾本科和十字花科植物腌制时乳酸菌属占比最高，证明此食材最合适乳酸菌属细菌的生长，其泌酸抑杂菌的能力最强，对条件致病性细菌，如本研究中优势菌群不动杆菌属、弓（形）杆菌属、克雷伯菌属以及大肠杆菌志贺菌（图3）有较强的抑制作用；所以，从此角度分析，禾本科和十字花科植物食材（如竹笋、芥菜）腌制的菜品，直接食用时比其他菜品相对安全；石蒜科植物食材如藠头（S02）腌菜存在较高比例的条件致病性细菌，如不经高温灭菌即食用，有较高被感染致病病原菌的风险。