当归对氧化应激损伤的大鼠髓核细胞增殖和胞外基质合成的影响

王新立，刘汝银，王西彬，岳宗进

河南省中医院脊柱科 郑州 450000

下腰痛是临床上的常见病，严重威胁人类健康[1]。研究[2]显示半数以上的下腰痛由椎间盘退行性病变造成。当椎间盘发生退行性病变时，髓核中的胞外基质降解且不能及时更新，导致椎间盘的生物力学特性发生变化，进而影响脊柱的稳定性[3]。研究[4]发现多种因素与椎间盘退行性病变的发生发展相关，如氧化应激、炎症和抽烟等。当归是一种常见中药，具有明显的抗炎和抗氧化活性[5-6]。研究[7]显示当归用于治疗腰椎间盘突出症疗效显著，且当归能够抑制髓核细胞的凋亡和自噬。但是当归对髓核细胞增殖和细胞外基质合成的作用尚未见相关研究。因此我们使用H2O2处理体外培养的大鼠髓核细胞，模拟氧化应激环境，探究当归对氧化应激损伤的髓核细胞增殖和胞外基质合成的影响和可能机制。

1 材料与方法

1.1材料大鼠椎间盘髓核细胞由本实验室保存，具体分离方法见文献[7]。当归注射液购于雅安三九药业有限公司，DMEM/F12培养基购于美国Thermo Fisher公司，胎牛血清、胰蛋白酶和青/链霉素双抗溶液均购于美国Gibco公司，MTT试剂盒和RIPA裂解液购于上海碧云天生物技术公司，H2O2溶液购于美国Sigma公司，RNAiso Plus购于大连宝生物有限公司，反转录试剂盒和UltraSYBR Mixture(with ROX Ⅰ)购于北京康为世纪有限公司，Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)购于北京全式金生物科技有限公司，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)3和c-Myc抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司，蛋白聚糖(Aggrecan)抗体购于美国Santa Cruz公司，Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ)、MMP9、β-catenin及β-actin抗体均购于美国Abcam公司。

1.2细胞培养和分组处于对数生长期的髓核细胞经胰蛋白酶消化后接种于含体积分数10%胎牛血清、青/链霉素双抗的DMEM/F12培养基中，在37 ℃，体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养24 h。实验分为对照组(不加任何干预)、H2O2组(加入400 μmol/L的H2O2刺激6 h)、H2O2+当归组(先加入1 g/L当归溶液培养24 h，然后加入400 μmol/L的H2O2刺激6 h)。

1.3细胞活力检测收集分组处理的髓核细胞，使用MTT试剂盒检测细胞活力。每孔加入10 μL 5 g/L的MTT溶液，在细胞培养箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL Formazan溶解液，充分混匀后继续培养，直至紫色结晶全部溶解。在570 nm波长处，使用酶标仪检测吸光度值，代表细胞活力。实验重复3次，下同。

1.4PCNA和CyclinD1蛋白表达的检测采用Western blot法。收集分组处理的髓核细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA法检测其浓度。取40 μg总蛋白，沸水浴煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳，分离蛋白。电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，加入50 g/L脱脂奶粉溶液封闭2 h后，加入一抗(PCNA和CyclinD1抗体，均按1∶1 000稀释)，4 ℃过夜孵育，1×TBST充分洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，洗膜后，将ECL发光液均匀加至膜上，拍照，以β-actin为内参进行灰度值分析。

1.5Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3和MMP9mRNA表达的检测按照RNAiso Plus试剂说明书操作，提取各组细胞的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度。使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，然后按照UltraSYBR Mixture说明书加入各试剂，进行Real-time PCR操作。反应体系：UltraSYBR Mixture 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40个循环。以GAPDH为内参，使用公式2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3、MMP9蛋白及β-catenin、c-Myc蛋白表达的检测采用Western blot法。方法同1.4，其中Aggrecan、MMP3、c-Myc抗体稀释度均为1∶1 000，Collagen Ⅱ、MMP9、β-catenin抗体稀释度分别为1∶500、1∶800、1∶1 200。

1.7统计学处理用SPSS 13.0处理数据。采用单因素方差分析比较3组以上各指标的差异，两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组细胞活力、PCNA和CyclinD1蛋白的表达与对照组相比，H2O2组细胞活力降低，PCNA和CyclinD1蛋白表达水平降低；与H2O2组相比，H2O2+当归组细胞活力增加，PCNA和CyclinD1蛋白表达水平升高。见图1、表2。

1、2、3：分别为对照组、H2O2组、H2O2+当归组

组别细胞活力/%PCNACyclinD1对照组103.333±10.0331.328±0.1281.068±0.089H2O2组49.167±10.722*0.410±0.093*0.156±0.069*H2O2+当归组87.833±9.745#0.920±0.084*#0.606±0.107*#F45.100 119.614 128.734 P<0.001 <0.001 <0.001

*:与对照组比较，P<0.05; #:与H2O2组比较，P<0.05

2.2各组细胞Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3和MMP9mRNA及蛋白的表达与对照组相比，H2O2组Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA和蛋白表达水平降低,MMP3和MMP9 mRNA和蛋白表达水平升高；当归可部分逆转H2O2引起的变化。见表3、图2、表4。

表3 各组细胞Aggrecan、Collagen Ⅱ、MMP3和MMP9 mRNA的表达(n=3)

*:与对照组比较，P<0.05; #:与H2O2组比较，P<0.05

1、2、3：分别为对照组、H2O2组、H2O2+当归组

组别AggrecanCollagen ⅡMMP3MMP9对照组1.353±0.0651.007±0.1030.050±0.0300.110±0.036H2O2组0.400±0.110*0.367±0.129*1.710±0.115*1.143±0.090*H2O2+当归组0.973±0.097*#0.827±0.087#0.930±0.088*#0.643±0.131*#F80.450 28.172 280.887 90.806 P<0.001 0.001 <0.001 <0.001

*:与对照组比较，P<0.05; #:与H2O2组比较，P<0.05

2.3各组细胞β-catenin和c-Myc蛋白的表达与对照组相比，H2O2组β-catenin和c-Myc蛋白表达水平升高；与H2O2组相比，H2O2+当归组β-catenin和c-Myc蛋白表达水平降低。见图3和表5。

1、2、3：分别为对照组、H2O2组、H2O2+当归组

组别β-cateninc-Myc对照组0.053±0.0350.410±0.095H2O2组0.987±0.100*1.267±0.139*H2O2+当归组0.520±0.090*#0.620±0.090#F101.205 49.247 P<0.001 <0.001

*:与对照组比较，P<0.05; #:与H2O2组比较，P<0.05

3 讨论

由增殖降低引起的基质产生细胞的减少是椎间盘退行性病变的一个重要因素[8]。PCNA和CyclinD1是两个重要的细胞增殖标志物[9]。本研究中H2O2刺激抑制了髓核细胞的活力，降低了PCNA和CyclinD1的表达。当归预处理明显增加了H2O2刺激的髓核细胞的活力，上调了PCNA和CyclinD1的表达，表明当归能够促进氧化损伤的髓核细胞增殖。

研究[10]显示，椎间盘中胞外基质的组成对于其功能的维持至关重要，胞外基质的降解会导致椎间盘高度的减小以及血管和神经数目的减少。髓核细胞负责椎间盘中胞外基质的合成和调控，控制胞外基质合成与降解的平衡。髓核细胞分泌的胞外基质主要为Aggrecan和Collagen Ⅱ。MMPs能够介导基质的降解过程，在椎间盘退行性病变中MMP1、MMP3、MMP7、MMP9和MMP13的表达和活性均增加[10]。此外，研究[11-12]发现在髓核细胞中MMPs表达上调会引起Aggrecan和Collagen Ⅱ含量的下降。因此，本研究使用H2O2诱导髓核细胞的氧化应激损伤，探究当归对髓核细胞中胞外基质合成的影响和分子机制。结果显示，与对照组相比，H2O2处理后髓核细胞中Aggrecan和Collagen Ⅱ的表达均下调，而MMP3和MMP9的表达均上调。这表明H2O2抑制了髓核细胞胞外基质的合成，促进了其降解，与之前的研究[13]结果相一致。与H2O2组相比，当归预处理增加了Aggrecan和Collagen Ⅱ的表达，下调了MMP3和MMP9的表达，这表明当归能够促进髓核细胞中胞外基质的合成，减少其降解。

Wnt/β-catenin通路的活化与椎间盘退行性疾病的发展密切相关。该通路能够加速髓核细胞的衰老，诱导MMPs的表达，促进胞外基质的降解[14]。c-Myc是Wnt/β-catenin通路下游的一个重要靶基因[15]。本研究结果显示，H2O2刺激后髓核细胞β-catenin和c-Myc的表达水平均增加，而使用当归预处理后髓核细胞β-catenin和c-Myc的表达水平均降低，提示当归可能通过抑制Wnt/β-catenin通路促进髓核细胞的增殖和胞外基质的合成。