凤丹牡丹多酚提取及其抗氧化活性研究

李佩璇 陈法志 李秀丽 戢小梅 陈志伟 翟敬华

摘要：为提高凤丹牡丹（Paeonia suffruticosa Fengdan）葉的多酚提取率，采用纤维素酶法提取叶中的多酚，以多酚提取量为考察指标，在单因素试验的基础上，选取纤维素酶用量、酶解温度、酶解时间、pH 4个因变量，进行响应面试验，建立各因变量与响应值之间的数学模型，确定最佳提取工艺条件。结果表明，曲面回归方程拟合性良好，其中纤维素酶用量和酶解温度的交互作用显著，得到多酚的最优工艺条件为纤维素酶用量150 U/mL、pH 5.0、酶解温度50 ℃、酶解时间105 min，在此条件下，多酚提取量达到34.66 mg/g，与模型预测值35.10 mg/g接近。凤丹叶片提取液对DPPH·清除率在提取液浓度为0.06 mg/mL时达到82.15%;对·OH清除率在提取液浓度为0.32 mg/mL时达到27.10%;铁氰化钾还原力在提取液浓度为10 mg/mL时，吸光度为3.41。

关键词：凤丹牡丹（Paeonia suffruticosa Fengdan）;多酚;酶法提取;响应面设计;抗氧化活性

中图分类号：S567.1+5         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）24-0187-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.046           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of in vitro antibacterial activity of antioxidant and

the extraction of Fengdan peony polyphenols

LI Pei-xuan，CHEN Fa-zhi，LI Xiu-li，JI Xiao-mei，CHEN Zhi-wei，ZHAI Jing-hua

（Institute of Forestry and Fruit Tree，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430075，China）

Abstract： In order to improve the comprehensive utilization rate of peony（Paeonia suffruticosa Fengdan） leaf of Fengdan resources， the polyphenols in the leaves of peony were extracted by cellulase method， and the polyphenols were used as the index. The effects of cellulase concentration， enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis time and pH value on the extraction of polyphenols in peony leaves were investigated by response surface. The results showed that the best condition for extraction of polyphenols from peony leaves by cellulase was： when the concentration of cellulase was 150 U/mL， the pH was 5.0， the enzymatic time was 105 min， the temperature of enzymatic hydrolysis was 50 ℃. Under this condition， the theoretical prediction value of polyphenol content was 34.66 mg/g. The antioxidant activity of the best condition for extraction was examined. The DPPH· scavenging abilities of Fengdan leaf extract reached 82.15% when the extract concentration was 0.06 mg/mL; the hydroxyl scavenging abilities reached 27.10% when the concentration was 0.32 mg/mL;reducing abilities of the potassium ferricyanide absorbance was 3.41， when the concentration of the extract was 10 mg/mL.

Key words： Fengdan peony（Paeonia suffruticosa Fengdan）; polyphenols; enzyme extraction; design of response surface; dntioxidant activity

牡丹（Paeonia suffruticosa）代表着富贵，外形美丽，具有“花中之王”之称，有较高的经济、观赏价值[1]。凤丹牡丹是由牡丹野生原种杨山牡丹经过长期栽培演化形成的观赏、食用兼药用的品种群，是中国油用牡丹栽培的主要类型，在山东、河南、河北、陕西、安徽、湖北、四川、江苏、湖南等省广泛栽培。凤丹牡丹的花、果实、根、叶均具有较高的开发利用价值，凤丹牡丹子油、花先后被国家卫生健康委员会批准为新资源食品。牡丹的花、叶中含有大量的酚类物质，具有提高免疫功能、抗心血管疾病、抗炎、抗肿瘤等多种生物药理活性[2-4]，在化妆品、食品添加剂等领域具有良好的开发应用前景[5]。史国安等[6]、吴龙奇等[7]、刘建华等[8]研究对比了不同种类的牡丹花、叶中营养成分，发现其均含有大量的多酚类物质、矿物质、微量元素及氨基酸等，且具有较强的抗氧化活性。

多酚类物质是植物中常見的一种成分，主要包括类黄酮、酚酸、花青素等物质，具有抗氧化、预防心血管疾病、抗炎抑菌、降血压等功效，有人类健康卫士之称[9-11]。国内外关于多酚的提取方法有溶剂提取法（Solvent Extraction，SE）、微波提取法（Microwave Assisted Extraction，MAE）、超声辅助提取法（Ultrasound Assisted Extraction，UAE）、超临界流体提取法（Supercritical Fluid Extraction，SFE）、酶法提取（Enzyme Extraction，EE）等[12]。与有机溶剂提取、超声辅助提取以及微波提取在规模化生产时的局限性相比，酶法提取具有对提取设备要求低、反应温和、反应过程简单等优点[13]。近年来，酶法提取已被广泛应用于生物活性物质的提取和研究中，而关于凤丹牡丹多酚提取的研究鲜见报道。因此，本研究采取酶法提取凤丹牡丹叶中多酚物质，并通过响应面优化得到最优的工艺条件，为凤丹牡丹资源综合利用提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  材料  凤丹牡丹叶采于2017年6月，采自武汉市农业科学院林业果树研究所郑店基地种植的5年生凤丹牡丹实生苗木。

1.1.2  试剂  没食子酸标准品，购自上海源叶生物科技有限公司;纤维素酶，购自日本Yakult工业股份有限公司;二苯代苦味酰基自由基（DPPH）， 购自美国Sigma公司;其他试剂未加说明均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2  仪器设备

ME203E型电子天平，i8型双光束紫外/可见分光光度计，EMS-50-双列十孔恒温水浴锅，TGL-20M高速离心机，TGCXN-2B超声循环提取机。

1.3  试验方法

1.3.1  凤丹牡丹叶纤维素酶解处理与提取  取新鲜的凤丹牡丹叶，洗净后自然晾干水分，50 ℃下真空干燥24 h，粉碎成粉末状，备用。取已粉碎牡丹叶片粉末1 g，在不同工艺下进行酶解后离心，保留上清液，对沉淀物进行水提（料液比1∶20，温度50 ℃，搅拌1 h）后离心，混合2次上清液，定容至100 mL。

1.3.2  多酚含量的测定  多酚含量的测定参照张亮亮等[14]的方法，求得回归方程为y=7.64x+0.254，R2=0.991 3。

1.3.3  单因素试验

1）纤维素酶用量的选择。准确称取已处理好的1 g凤丹牡丹叶粉末，分别加入浓度为50、100、150、200、250 U/mL的纤维素酶溶液1 mL，在酶解温度50 ℃、pH 5.0的条件下酶解100 min，测定不同纤维素酶用量对多酚提取量的影响。

2）pH的选择。准确称取已处理好的1 g凤丹牡丹叶粉末，加入浓度150 U/mL的纤维素酶溶液1 mL，在酶解温度50 ℃条件下，分别在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的条件下酶解100 min，测定不同pH对多酚提取量的影响。

3）酶解时间的选择。准确称取已处理好的1 g凤丹牡丹叶粉末，加入浓度150 U/mL的纤维素酶溶液1 mL，在酶解温度50 ℃、pH 5.0的条件下分别酶解40、60、80、100、120 min，测定不同酶解时间对多酚提取量的影响。

4）酶解温度的选择。准确称取已处理好的1 g凤丹牡丹叶粉末，加入浓度150 U/mL的纤维素酶溶液1 mL、调节pH至5.0，分别在40、45、50、55、60 ℃温度下提取100 min，测定不同酶解温度对多酚提取量的影响。

1.3.4  响应面试验  根据单因素试验结果，通过Design-Expert 7.0软件进行响应面优化设计，以多酚提取量（Y）为响应值，以酶用量（A）、pH（B）、酶解时间（C）、酶解温度（D）为因变量，设计4因素3水平的响应面试验，因素与水平见表1。

1.3.5  DPPH自由基清除率的测定  参照赵鑫等[15]的方法，将原液浓度调整为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。

1.3.6  羟基自由基清除率的测定  参照陈佳龄等[16]的方法，将加入原液的量调整为稀释10倍后的原液0.16、0.20、0.24、0.28、0.32 mL。

1.3.7  铁氰化钾还原力的测定  参照秦建华等[17]的方法，吸光度越高，代表还原力越强。

2  结果与分析

2.1  纤维素酶法提取凤丹牡丹多酚的单因素试验结果

2.1.1  酶用量对凤丹牡丹叶多酚提取量的影响  由图1可知，在考察浓度范围内，多酚提取量随纤维素酶用量的增加呈先增大后减小的趋势，当酶用量为150 U/mL时，多酚提取量最大。其原因主要为酶用量增加会加快酶促反应速率，细胞壁裂解加速，多酚物质溶出;但当底物饱和时，酶促反应达到平衡，且酶蛋白分子的聚集也阻碍了细胞内物质的扩散。因此，选取酶的最适用量为150 U/mL。

2.1.2  pH对凤丹牡丹叶多酚提取量的影响  由图2可知，随着反应体系pH增大，多酚提取量呈先升高后下降趋势，当pH为5.0时，多酚提取量达到最大。原因可能是pH对酶活影响较大，酶在适宜的pH下活力最强，相反pH过高或过低都会影响酶活。因此，选取最适pH为5.0。

2.1.3  酶解时间对凤丹牡丹叶多酚提取量的影响  由图3可知，在考察时间范围内，随着酶解时间的延长，多酚提取量呈上升趋势，当反应时间为100 min时，多酚提取量开始呈缓慢下降趋势。其原因可能随着酶解时间的延长，细胞内多酚物质可以充分溶出，但时间过长会导致多酚类物质被氧化。因此，选取最适的酶解时间为100 min。