阿霉素结合骨修复材料应用于骨肉瘤治疗的研究进展

孙郁文，魏鹏，陈启旺，魏珂

(1.宁波大学医学院，浙江 宁波 315000；2.浙江省宁波市第一医院手足显微及修复重建外科，浙江 宁波 315000；3.浙江省宁波市第九医院骨科，浙江 宁波 315000)

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤，20世纪70年代以广泛根治性切除手术治疗为主，但患者术后生活质量差。随着新辅助化疗的出现，5年生存率提升了40%[1]，使得保肢手术与截肢手术5年生存率相近，分别为62%与58%，复发率分别为8.2%和3.0%。在相近治疗效果下，保肢手术是更好的选择。但是术后肿瘤复发与骨缺损是困扰临床的两个难题，如何在促进骨细胞生长同时起到抗肿瘤细胞作用是我们的研究目的。最常见的化疗方案为大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)、阿霉素(doxorubicin，ADM)联合顺铂(cisplatin，DDP)的化疗方案(简称为MAP方案)，其中阿霉素使用时间最长，效果最为肯定。作为蒽环类抗肿瘤药物，阿霉素通过干扰转录过程阻止信使核糖核梭(Messenger RNA，mRNA)的形成，对骨肉瘤细胞有明显的杀伤作用。但是长期应用阿霉素后，药物的耐受性及毒副作用如心脏毒性、骨髓抑制和胃肠道反应也十分明显。将药物包封在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)等微粒中或者与骨修复材料结合在一起，通过局部缓释，可以明显降低其毒副作用[2]。本文回顾阐述近年来阿霉素或载阿霉素的缓释微球与骨修复材料相结合应用于骨肉瘤方面的进展研究，探讨其用于骨肉瘤治疗的发展方向。

1 阿霉素缓释载体的特点

应用于骨肉瘤治疗的阿霉素载体种类有很多，主要有聚脂类、凝胶类、多糖类、脂质类、蛋白类等。这些载体构成的体内传递系统都有一定的共性：a)具有良好的生物相容性；b)具有一定的缓释性，可以减少阿霉素的生物毒性；c)通常可以在本身基础上再进行修饰与改良，使其增加靶向性、稳定性或者其它特性。但这些研究多停留在实验室或者动物实验阶段，不同载体的实验结果类似，载体之间直接比较的资料较少，故优劣难以具体评判。在阿霉素与骨修复材料相结合治疗骨肉瘤的研究中，大多数学者还是选择单纯阿霉素或者阿霉素-PLGA缓释微球。一方面可能是因为与骨修复材料结合使用，是局部用药而非全身用药，靶向优势不能充分体现；另一方面则可能考虑到药物与骨修复材料制作结合过程中的稳定性问题。近年来研究的新型载体大多都具有靶向性，并能克服一定的耐药问题，与以往传统载体相比拥有优势。以下列举一些常见的阿霉素载体的性能。

1.1 凝胶类 水凝胶是一种亲水性高分子聚合物，可以保持大量水分又不溶解，在外界的条件刺激下发生溶胀或者收缩，常见的有温度敏感性、pH敏感性、磁场敏感性等，有些水凝胶拥有多种敏感性。其中pH敏感性水凝胶能够根据体内pH值、离子强度进行体积的变化，从而控制释药速率，起到靶向作用，在抗肿瘤治疗研究中应用广泛[3]。

1.2 聚酯类 以PLGA为代表，无毒、无刺激性，且生物相容性好，早于1995年便已通过美国FDA认证用于人类疾病的治疗。研究表明，阿霉素-PLGA缓释微球对骨肿瘤细胞有明显的抑制效果，一方面是因为其具有缓释作用，可以使药物持续时间增加，另一方面是因为微球进入细胞方式是以胞吞作用为主，所以在低药物浓度环境下仍可以实现胞内的高药物浓度，起到较好的细胞杀伤作用[4]。不过PLGA本身有相对较高的疏水性、较高的药物突释和较低的靶向性，故在阿霉素与PLGA结合后，需再加上一些表面修饰，可使药物具有pH敏感、磁场靶向递送作用[5-6]。阿霉素药物在直接应用中还面临耐药的问题，通过对PLGA的表面修饰，有望在提升药物抗肿瘤性能的同时提高耐药性[7]。阿霉素-PLGA微球作为近年来新型载药纳米微粒的代表，其制备方式、特征、体外释放实验等研究已成熟，并具有成为靶向化疗药物的潜力，优势明显，目前常常替代阿霉素与骨修复材料结合使用。

1.3 多糖类 以壳聚糖、葡聚糖为代表。壳聚糖除了有良好的生物相容性、稳定性、可降解性外，还有抗菌、止血等独特的性质，缺点是分子为紧密的晶体结构，只能溶于弱酸性溶液，在应用上有了一定的限制[8]，不过通过改良可以合成出的水溶性较好的衍生物[9]。葡聚糖水凝胶有亲水性强，药物负载量大的特点，它的物理特性特别适合用于蛋白质的转运[10]，故葡聚糖常常被作为基因递送的模块，通过改性后可以与质粒结合，取得分子靶向性，可以将阿霉素高效递送致骨肉瘤细胞，化学疗法与癌症基因疗法相结合对克服抗药性可产生协同作用[11]。

1.4 脂质类 脂质体技术作为医学中最早、最重要的纳米技术，通过改变生物活性分子来纠正不利的物理化学性质，改善治疗药物的传递，控制药物的释放，并通过选择性递送至生物靶标来增强治疗功效并减少毒素反应。脂质体的配方很多，包封率高，往往可以根据不同的需要来进行开发，采用不同的配体可以有不同的靶向目标，比如可以针对CD44蛋白[12]、跨膜酪氨酸激酶受体[13]，也可以呈现不同的靶向特性，如氧化还原敏感性[12]、pH敏感性[14]、磁敏感性等。

1.5 蛋白类 以纤维蛋白原微球、丝素蛋白微球为例进行说明，纤维蛋白原是血浆中的一种糖蛋白，生物相容性好，药物载体通过和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列结合能使其具有肿瘤靶向性质，再同阿霉素通过接头接合，可以在弱酸环境下促进载体药物释放，具有一定的pH敏感性[15]。丝素蛋白来源方便、成本低廉，有良好的力学性能，可塑性强，可以通过化学修饰改变性能[16]。

1.6 其它 除了上述载体以外，明胶、碳酸钙纳米晶体、细菌磁小体等均可作为阿霉素的载体。明胶是天然水溶性高分子材料，能促进细胞的生长与分化，促进组织的再生修复等。但它的缺点包括性能不稳定、批次之间性能差异较大而且明显易受潮、机械强度不足等[17]。有实验将PLGA支架与可降解明胶支架作对比后证明，明胶支架更易于降解，而PLGA缓释性能更佳[18]。碳酸钙纳米晶体有pH敏感性，可以在弱酸环境中实现药物的靶控释放[19]。细菌磁小体可以同时载有质粒与阿霉素，使基因治疗与化学治疗相结合，提高药物耐药性，并且可同时具有磁性与温敏特性，增加了靶向性与可控性[20]。

2 骨修复材料在骨缺损中的应用

应用于骨缺损中的骨修复材料种类很多，大致可分为传统骨修复材料与现代骨修复材料。传统材料容易获得，制作的难度与成本相对较低，但是存在免疫排异、生物活性较低等缺点，而现代骨修复材料的研究技术更加微观，随着纳米技术、基因工程、复合材料的进步，可以使其取得更加仿生化的结构，提高骨再生与骨修复的能力，但是研究成果尚未成熟，还不能将各项优点相互整合，临床的安全性与经济成本仍待考核。复合材料的出现，打破了传统骨修复材料与人工骨修复材料间的界限，单纯的骨修复材料难免有其局限性，骨修复材料与生物因子、基因工程结合，或者通过纳米化调整微观结构以提升骨生物特性与骨修复能力逐渐成为主流。

2.1 传统骨缺损修复材料

2.1.1 生物骨 自体骨是骨缺损修复材料中的金标准，但骨量有限、取骨的并发症等限制了自体骨应用。同种异体骨与自体骨相比来源广泛，形态不受限制，经过深冻和处理后，无传染性、免疫性疾病，可以作为自体骨的可靠替代品，但是它的免疫原性会影响细胞黏附和分化，此外还有延迟愈合和感染等风险。异种骨免疫原性更强，应用于人体必需经过处理，但处理后其骨的生物活性与骨诱导能力不足，于是学者开始通过将异体骨与其它修复材料、相关因子复合，在避免排异的前提下加强其骨诱导、骨愈合的能力[21]。脱钙骨基质是同种异体骨或者异种骨经过了脱钙处理，具有良好的骨传导、骨诱导的能力[22]，但是由于失去了无机盐成分，使其丧失了力学特性，不能用于承重。近年来在复合骨修复材料的研究中，脱钙骨基质也开始成为主流支架材料，用以促进骨间充质细胞的迁徙与分化。

2.1.2 无机材料 常见的无机材料主要包括磷酸钙、羟基磷灰石、珊瑚等。磷酸钙降解性较羟基磷灰石好，成骨能力强，材料丰富，大小形态可自由控制，可用于修复不同形状的骨缺损。羟基磷灰石是骨骼中主要的无机成分，骨结合能力强，经常被用于假体的表面涂层，作为一种骨黏合剂，近年来对羟基磷灰石有了进一步的改进：通过孔径与孔隙率的调整改进力学特性，通过与生物活性因子结合提高骨诱导能力，通过载有抗骨质疏松药物起到更好的成骨效果。磷酸钙主要是指β-磷酸三钙，有良好的降解性、生物相容性、骨传导性，它最大的特点是形态的灵活性，可以制备成陶瓷、骨水泥、颗粒状。单纯磷酸钙，使用时由于脆性高、力学性能差不适合用于承重部位[23]，而磷酸钙骨水泥通过纳米化结合壳聚糖和聚乳糖纤维，抗弯强度明显提升[24]。珊瑚主要成分是碳酸钙与少量有机质，均有良好的三维管状结构，适合骨细胞的长入，是良好的骨支架材料，如果结合生物因子、基因疗法等，也有良好的使用前景[25]。

2.2 现代骨缺损修复材料

2.2.1 高分子材料 天然高分子材料种类较多，如胶原、甲壳素、壳聚糖、透明质酸、大豆蛋白等，可以促进细胞黏附与生长，但是因为降解率过快、机械强度不足，难以单一作为骨修复材料。人工高分子材料包括聚乳酸及其复合物、聚己内酯等，生物相容性较差，细胞黏附能力弱，不过机械强度优于天然高分子材料，而且成分、性能稳定，易于制备。人工高分子材料还可以与生长因子、生物陶瓷、传统高分子材料等其它材料相结合，制备复合材料，在保留各种材料自身优点的基础上调整成分与微观结构，提升生物活性[7]。

2.2.2 组织工程骨 组织工程骨一般是将纳米技术运用于骨修复材料的合成与改性，提高骨修复材料的骨传导、骨诱导与成骨性质能力，使其具有良好的生物相容性及三维结构。常见的组织工程骨是将种子细胞、生长因子和支架材料结合，而支架材料作为工程骨的主体，需要模拟细胞的三维多孔结构，使其能促进细胞黏附与生，同时具有良好的机械特性，用以骨缺损处的支撑，纳米材料被广泛应用于组织工程骨中[26]。此外，以3D打印为代表的叠加制造技术也能制备出良好骨传导性与机械特性的多孔支架[27]，基因工程可以促进种子细胞的增殖、分化，降低抗原性[28]，生长因子的植入也能提高骨修复材料的生物活性[29]。不过组织工程骨目前大多仍处于实验研究与动物研究阶段，其安全性与实用性仍需得到进一步的验证。

3 阿霉素或阿霉素-PLGA微球与骨修复材料结合的应用

3.1 阿霉素或阿霉素-PLGA微球掺入骨水泥 早在1987年，Lösche等[30]学者已经成功将阿霉素和氨甲喋呤与骨胶结合制得了载药的骨修复材料，在当时取得了良好的效果。Guan等[31]实验研究发现阿霉素浸渍到骨水泥中后，骨水泥中的药物可以在体外持续释放14 d，而在山羊体内药物释放时间为35 d，同时无明显的炎性反应，在用以治疗大鼠骨肉瘤实验里显示肿瘤抑制率达到54%。阿霉素或阿霉素-PLGA微球掺入到骨水泥中，是将抗肿瘤药物与骨移植材料结合的早期使用方式，能够实现在局部应用阿霉素抗肿瘤的同时促进骨修复。相关实验提示，通过将阿霉素裸药制备成缓释微球，可以在不增加药物剂量的前提下提高局部药物浓度，增强治疗效果[32]。

3.2 载阿霉素-PLGA微球的纳米羟基磷灰石/胶原复合支架(ADM-PLGA-NHAC复合支架) 羟基磷灰石和胶原分别是人体骨骼中主要的无机成分与有机成分，纳米羟基磷灰石/胶原复合支架(Nano-HAp/Collagen，NHAC)属于仿生复合材料，生物活性和骨传导性良好，同时无免疫原性、易降解，是用于骨缺损的理想材料[33]。NHAC以鼠尾胶原与纳米羟基磷灰石(Nano-HAp，NHA)为材料制备，将阿霉素-PLGA微球通过冷冻干燥法结合制备而成，ADM-PLGA-NHAC复合支架，空隙率为100～200 μm，孔隙率为82%，28 d内可持续释放阿霉素。体外抑瘤结果显示ADM-PLGA-NHAC支架的浸提液对骨肉瘤MG63细胞有较强的抑制作用，并存在剂量依赖性，实验表明局部植入ADM-PLGA-NHAC复合支架在抑制肿瘤同时，可以明显降低阿霉素的毒副作用，同时不影响NHAC的骨修复作用[34-35]。

3.3 载阿霉素的碳酸钙/四乙烯五胺-石墨烯(CaCO3/rGO-TEPA)微球 碳酸钙(CaCO3)作为一种生物矿物，与骨组织结构接近，安全性及生物相容性好，同时具有pH敏感性和缓慢的生物降解性，CaCO3纳米颗粒因其具有pH依赖性以及用靶向剂的潜力，被用于抗癌药物的靶向递送。而且，CaCO3基质的降解缓慢，亦可起到缓释作用[36]。四亚乙基五胺-石墨烯(rGO-TEPA)是具有一个原子厚度的二维层状结构，带有氨基(-NH2)基团，可以作为理想的矿化基质来诱导碳酸钙矿化[37]。CaCO3/rGO-TEPA杂化载体便是通过用四乙烯五胺-石墨烯(rGO-TEPA)在溶液中矿化CaCO3晶体获得，与其他CaCO3/聚合物杂化颗粒相比，制备的CaCO3/rGO-TEPA微球表面为多孔结构，内部为中空结构，可以提高药物分子的负载能力，MTD法测定评估CaCO3/rGO-TEPA微球的生物相容性好并无毒[38]。阿霉素-PLGA加载和释放测量显示，pH值为7.4和5.0时，杂化微球载体的负载效率为94.7%，释放效率为13.8%和91.7%，在偏酸性环境中可以有更好的释放能力[39]。CaCO3/rGO-TEPA杂化微球因其具有pH敏感、释放性能温和等优点，因此具有良好的缓释性能。

3.4 载阿霉素的磷酸钙磷酸化腺苷(calcium phosphate-phosphorylated adenosine，CPPA)杂化微球 磷酸钙磷酸化腺苷(CPPA)属功能性无机-有机杂化系统，磷酸钙具有良好的生物相容性和生物活性，可通过改善碱性磷酸酶和增强骨桥蛋白合成来增强骨诱导和骨形成，无明显的细胞毒性[40]。具有独特结构的无定形磷酸钙(ACP)颗粒比表面积大，与骨组织无机成分相似，可用于药物输送，还可被细胞生物降解，是促进骨缺损修复的理想材料[41]。而腺苷在代谢的能量转移中起重要作用，同时腺苷还对骨代谢产生影响，可以调节成骨细胞和破骨细胞分化，使其有可能用于治疗和预防多发性骨髓瘤相关骨病[42-43]。考虑到腺苷与磷酸钙的优点，Zhou等[44]通过微波辅助溶剂热法合成CPPA混合微球，CPPA具有中空和多孔结构、阿霉素负载能力、pH依赖性。通过对裸鼠中的各种骨肉瘤细胞系和皮下肿瘤进行实验，显示CPPA可促进人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)的成骨分化。

3.5 载阿霉素的磁性介孔钙硅酸盐/壳聚糖(mesoporous calcium sillicate/chitosan，MCSC)多孔支架 MCSC多孔支架是由壳聚糖(chitosan molecules，CS)、介孔硅酸钙(mesoporous calcium sillicate，MSC)以及M型铁氧体颗粒(SrFe12O19)制备而成。壳聚糖、介孔硅酸钙作为骨修复材料，相容性、降解性好，并具有生物活性，尤其是介孔硅酸钙的微孔结构，有良好的比表面积(单位质量物料所具有的总面积)，利于药物的传递，而且在降解过程中可以使周围环境呈弱碱性，有利于骨组织修复。M型铁氧体颗粒作为一种光热剂，与传统光热剂相比，具有更好的近红外吸光度、光热转换效率、导热性等优点[45-46]，在光热疗法下，经近红外光照射后可使肿瘤周围温度升高至42～50℃，以促进热疗消融，同时可以促进药物的释放与渗入[47]。同时有研究提示在体外通过静磁场、负载磁性纳米颗粒的生物支架也可以促进成骨分化和骨形成[48-49]。M型铁氧体颗粒与目前的磁性氧化铁纳米颗粒(例如Fe3O4)相比，具有更强的磁性，所以MCSC支架可以加载阿霉素等抗肿瘤药物，通过与光热疗法协同发挥作用，另外，MCSC支架由于其磁性可以促进骨髓间充质干细胞的增殖，在骨肿瘤手术切除后骨缺损患者的临床中有实用价值[50]。

3.6 载阿霉素缓释微球的去细胞骨膜复合支架 去细胞骨膜支架是通过冻融、洗涤、酶消等方式将动物骨膜实现去细胞化，去除具有抗原性的细胞成分，而保留细胞外基质的固有结构，以促进骨细胞的黏附与分裂，增加骨修复的能力[51]。目前已有研究成功制备载阿霉素明胶微粒的去细胞骨膜支架与载阿霉素-PLGA微球的去细胞骨膜支架，结果显示两种微球的去细胞骨膜均具有良好的生物相容性与缓释能力，在体外对癌细胞具有抑制作用，通过局部释放阿霉素，在不增加剂量的同时提高抗肿瘤效果。实验还分别测定了PLGA微粒与明胶微粒分别与去细胞骨膜交联后的性能，显示载阿霉素-PLGA微球的骨膜支架能够保留更高的载药量[52]。PLGA微球与明胶微料相比，材料性能更加稳定，药物的缓释效果更好，还可以通过修饰改性调控其性能[29]，故以PLGA微球作载体应该会有更好的应用前景。不过到目前为止，去细胞骨膜刺激骨修复的能力尚未得到实践证实，需进一步地研究来应证。

4 展 望

阿霉素局部应用与阿霉素缓释微球已证实可以减少治疗骨肉瘤的毒副作用，如今我们希望能有新的进展，在骨肉瘤的治疗中能兼顾肿瘤复发、骨缺损两大难题。目前在骨肉瘤治疗的研究中，尚未发现能有效、成熟的集骨修复与抗肿瘤一体的骨修复材料。上述复合支架、微球的研究，一方面降低阿霉素毒副作用、提高载药量，另一方面通过结合一种骨修复材料来刺激骨组织生长，理论上均有一定的效果，但难分优劣。同时骨修复材料种类繁多，目前复合支架、微球选择的材料与制备方式未必最理想，我们可以继续探索寻找并进行比较。综上所述，在阿霉素及其缓释微球结合骨修复材料的研究有较大的开拓发展空间，还需通过比较评估效果，寻找一种理想的复合材料，这个更具有现实意义。