采用人体静脉血体外模拟制备混合性血栓的试验研究

史 琪， 关丽娜， 麦培培， 马 婷， 穆玉明

(新疆医科大学第一附属医院心脏超声科， 乌鲁木齐 830054)

目前溶栓试验研究中应用的血栓多采用的是由静脉血体外自凝形成的以红细胞为主的红色血栓[1-4]，是构成动脉血栓尾部的主要组成成分，其自身结构疏松、易碎，不能真实有效的反映体内溶栓效果[5-6]。而动脉内血栓的主体部分主要是以血小板小梁和纤维网状结构为主的混合性血栓[5-6]。与动脉血比较，静脉血除携氧量不同外其余血液成分均一致，并且采集和止血均较方便，因此本研究应用的是人静脉血模拟制备动脉内的混合性血栓，如何应用人静脉血加入不同物质能形成混合性动脉血栓是目前本研究的关键所在。因此，本研究通过探讨一种应用人静脉血加入不同促凝血物质的方法，实现体外成功模拟制备混合性动脉血栓，再应用溶栓药物对其溶解来观测其溶栓效果，以达到应用静脉血体外成功制备混合性动脉血栓的目的。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂低温离心机(Thermo,美国)，恒温箱(SLI-400，日本)，电子天平(BS 200 S,北京)，枸橼酸抗凝管(灵岩医疗有限公司，苏州)，自凝管(灵岩医疗有限公司，苏州)，无菌EP管(AXYGEN，美国)，腺苷二磷酸(ADP，索莱宝，北京)，凝血酶(索莱宝，北京)，磷酸缓冲盐溶液(PBS液，HYclone，美国)，4%多聚甲醛(博士德，武汉)，抗体CD42(abcam,英国)，山羊抗兔二抗(中杉金桥，北京)，Occludin免疫组织化学试剂盒(abcam,英国)，重组型纤溶酶原激活物(rt-PA，勃林格殷格翰药业，上海)。

1.2血栓的制备方法及分组本研究符合人体试验的伦理学标准，已通过新疆医科大学第一附属医院伦理审查委员会批准(审批号：20170608-01) 。

1.2.1 纳入及排除标准 纳入标准：(1)年龄 25～60岁，性别不限。(2)无吸烟史。(3)2周内未服用过抗凝剂和血小板功能抑制剂及非甾体抗炎药物，排除影响凝血功能及纤维蛋白原合成的疾病。(4)血红蛋白含量、血小板数量、凝血功能及纤维蛋白原浓度在正常范围。排除标准：(1)>60岁，有吸烟史。(2)冠心病、脑梗塞病史者。(3)在服用抗凝剂和血小板功能抑制剂及非甾体抗炎药物，有影响凝血功能及纤维蛋白原合成的疾病。(4)血红蛋白含量、血小板数量、凝血功能及纤维蛋白原浓度异常者。

1.2.2 血栓制备及分组 抽取12个健康人静脉血,18 mL/人，根据血栓制备方法的不同分为A、B、C、D组，对照组(E组)为急性心肌梗死患者发病2 h内冠脉内抽取的混合性血栓。每组均有12个血栓(n=12)，每个血栓大小重约(120.2±2.9)mg，所有血栓均在37.0℃恒温箱中孵育40 min。

A组：(单纯静脉血)：3 mL静脉血放入自凝管中，自凝形成血栓[1]。

B组(静脉血+CaCl2)：3 mL静脉血放入枸橼酸盐抗凝管中，加入CaCl280 mmol/L[7]。

C组(静脉血+CaCl2+凝血酶)：3 mL静脉血放入枸橼酸盐抗凝管中，加入CaCl280 mmol/L、凝血酶(0.5 IU/mL)[8]。

D组(静脉血+CaCl2+凝血酶+ADP)：9 mL静脉血放入枸橼酸盐抗凝管中，在180 g离心力下离心10 min，最上层的是富含血小板的血浆层(PRP层)，中间层为白细胞层，最下层是富含红细胞层。分别抽取3.5 mLPRP层，0.5 mL含白细胞、红细胞的边界层，混合注入5 mLEP管中，再加入ADP(80 μmol/L)、凝血酶(0.5 IU/mL)、CaCl2(80 mmol/L)。

E组(对照组)：急性心肌梗死患者发病2 h内冠脉内抽取的混合性血栓。

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1.3病理学检查

1.3.1 标本的制备 HE、免疫组织化学、Masson染色组织用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切成厚4 μm切片。免疫组织化学中血小板特异性抗体CD42一抗稀释度为1∶200。扫描电镜：戊二醛固定12 h，常规脱水，冷冻干燥，喷金，电镜下观察标本。

1.3.2 结果判断 混合性动脉血栓表现[5-6]：(1)HE染色出现大量均质粉染不规则的条状血小板小梁形成。(2)免疫组织化学染色出现棕黄色或棕褐色的强阳性表现。(3)Masson染色可见大量均质蓝染不规则的条状胶原纤维生成。(4)扫描电子显微镜(SEM)可见大量致密的纤维网状结构生成，内可见活化的血小板、红细胞及炎性细胞。红色血栓表现[5-6]：(1)HE染色可见均质桔染的红细胞。(2)免疫组织化学染色无棕黄色或棕褐色的阴性表达。(3)Masson染色无或仅可见断续细丝状蓝染的胶原纤维生成。(4)扫描电子显微镜(SEM)仅有少量松弛或无纤维网状结构形成，有或无活化的血小板，内可见大量以红细胞为主的全血细胞填充。

1.4各组血栓的体外药物溶栓效果评价

1.4.1 体外溶栓 血栓形成后将其从EP管中取出，用PBS液清洗，清洗至PBS液清亮，切割成大小约(120.2±2.9)mg。每个血栓均放入EP管中，在37℃恒温箱中溶栓30 min， 重组型组织纤溶酶原激活物(rt-PA)溶栓组：rt-PA溶于2 mL PBS液中(rt-PA浓度60 ku/mL)，PBS液空白对照组：5 mL EP管中放入PBS液2 mL。溶栓后血栓用电子秤称重，为减小误差每次称重持续时间不超过20 s。

1.4.2 裂解率测定 根据质量守恒定律，通过测量溶栓前(M0)、后(M1)血栓的质量差与溶栓前血栓质量的比值来计算血栓裂解率。M为血栓裂解率，计算公式如下：M=(M0-M1)/M0×100%。

2 结果

2.1各组血栓形成后的病理结果仅有D组主要病理结构与对照组E组一致。D组，HE染色可见大量呈条状连续分布均质粉染的血小板小梁结构生成；免疫组织化学染色血小板呈棕褐色聚集状分布，可见大量棕褐色聚集状分布堆；Masson染色可见大量不规则条状连续均匀蓝染的胶原纤维分布；SEM可见大量粗大的纤维束相互交错形成致密的纤维网，内可见活化的血小板及红细胞。

A、 B、C组病理结构符合红色血栓，HE染色可见均质红染的血细胞；免疫组织化学染色无或极少见有棕褐色血小板分布；Masson染色无或仅可见丝状少量蓝染的胶原纤维丝；SEM可见少量纤细的纤维蛋白丝连接在细胞之间，无明显纤维网形成(图1)。

图1 各组血栓形成后的病理结果

2.2溶栓前、后各组血栓质量及裂解率rt-PA溶栓试验中,裂解率最好的是D组，其他组均存在不同程度的溶解，D组与A、B、C组两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 溶栓前、后各组血栓质量及裂解率

注:与D组比较，*P<0.01。

3 讨论

本研究应用人静脉血的成分血+CaCl2+凝血酶+ADP的方法在体外成功制备了血栓，经病理证实该血栓是以血小板小梁和纤维网状结构为主的混合性血栓，其主要病理结构与体内混合性动脉血栓一致。因此应用人静脉成分血+CaCl2+凝血酶+ADP是制备混合性动脉血栓的最佳方法。

血小板小梁、活化的血小板以及致密的纤维网状结构是构成混合性动脉血栓的主要病理结构。经本研究病理改变证实，仅有D组血栓的主要病理结构与E组一致，其内既含有大量的血小板小梁、活化的血小板，又含有大量粗大的纤维蛋白及相互交错形成的致密纤维蛋白网，符合体内混合性动脉血栓的主要病理结构，与Roessler等[9]的研究结果一致。而C组仅加入凝血酶后，结构中虽然可见有纤细的纤维蛋白以及极其疏松的网状结构生成，大量血细胞填充，但无活化的血小板及血小板小梁生成，其本质仍是以红细胞为主的红色血栓，不符合混合性动脉血栓的病理结构改变。A、B组静脉血自凝形成的血栓中仅可见极少量纤细纤维蛋白，无纤维蛋白网状结构的生成，其病理结构为红色血栓。因此静脉血的成分血中同时加入ADP和凝血酶可形成以血小板小梁、活化的血小板以及致密纤维网状结构为主的混合性动脉血栓，并且这两种促凝物质是形成该血栓的关键因素。

本研究结果显示，rt-PA溶栓试验中，D组的裂解率最好，可能是与溶栓药物rt-PA主要溶解血栓内纤维网状结构成分有关[10]，综合各组病理结果考虑分析仅有D组与体内溶解动脉内混合性血栓的病理过程较相符。

综上所述，本研究应用人静脉血的成分血+CaCl2+凝血酶+ADP可以在体外制备以血小板小梁、活化的血小板及致密纤维网状结构为主的混合性动脉血栓。