构建小型猪慢性阻塞性肺疾病合并早期肺心病的模型*

杨 智,付 兵,李春平,李 睿,杨 帆,杨大兴,王文斌

(1.四川省成都市第五人民医院放射科 611130；2：川北医学院附属医院放射科，四川南充 637000)

有研究表明，我国每年有将近100多万慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者死亡，同时COPD也位于我国疾病负担的第2位[1]。COPD合并肺源性心脏病(肺心病)是COPD疾病发展的必然进程和最终结局，也是严重降低患者劳动能力、生活质量及致死的最重要因素[2]。虽然对COPD合并肺心病目前进行了较多的研究，但是部分发病机制及疾病的相关预防和治疗至今未被完全阐明。因此，建立符合人类病因及病程发展、且能完成临床治疗与随访的COPD合并早期肺心病的动物模型一直是国内外学者追求的目标和努力的方向[3]。本实验主要从肺功能、心脏磁共振成像、病理切片等方法测定肺总量、功能残气量、吸气气道阻力、呼气气道阻力、右心室舒张末期质量、右心室舒张末期容积、肺组织及心肌细胞的组织学改变，来探讨反复气管内滴注木瓜蛋白酶和胰蛋白酶建立COPD合并早期肺心病小型猪模型方法的可靠性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取小型猪15头为造模组，由川北医学院动物实验中心提供，其中雄性10头，雌性5头，体质量20～30 kg，猪龄8～9个月。

1.2方法

1.2.1建立COPD合并早期肺心病模型 实验第1周制备COPD合并早期肺心病模型方法：星期二在所有小型猪麻醉前30 min肌肉注射阿托品(0.4 mg/kg)，随后于颈部肌肉注射地西泮20 mg，待小型猪安静后，于小型猪耳缘静脉建立静脉通道，经通道分3次注入氯胺酮(20 mg/kg)及异戊巴比妥钠(80 mg/kg)进行麻醉，麻醉满意后将其固定于特定的动物支架上，然后对小型猪进行气管内插管，将木瓜蛋白酶6 U/kg稀释成20 mL的生理盐水经气管插管内注入；星期五重复上述小型猪麻醉及固定方法将胰蛋白酶300 U/kg稀释成20 mL生理盐水注入气管内。实验第2～20周重复上述第1周的造模方法。所有实验动物均喂养于川北医学院动物实验中心，小型猪饲料及饮用水由动物实验中心供应。

1.2.2小型猪肺功能测定与心脏磁共振检查 于造模的第0～20周每周六重复上述麻醉，麻醉后采用AniRes2003动物肺功能分析系统(中国北京贝兰博科技有限公司生产)来测定造模小型猪的肺总量(TLC)、功能残气量(FRC)、吸气气道阻力(Ri)、呼气气道阻力(Re)。造模小型猪肺功能测定完成后，将麻醉的小型猪转运入川北医学院附属医院放射科进行心脏磁共振扫描，并测定右心舒张末期容积及右心舒张末期质量，具体扫描及测定方法见文献[4-5]。

1.2.3病理标本的采取及处理方法 将死亡的造模小型猪的肺、心脏组织常规采用4%甲醛进行组织固定，然后常规脱水、包埋、苏木精-伊红(HE)染色、制成石蜡切片，于光镜下观察肺组织及心脏的病理形态学改变。

2 结 果

2.1造模小型猪一般情况 造模第5周末造模小型猪死亡2头，死亡原因为造模后肺部出现感染。造模第11周末死亡2头，死亡原因为造模过程中引起急性大咯血窒息。造模第16周末死亡1头，死亡原因为急性肺部感染。造模第20周末完成实验后死亡4头，为麻醉后的肺部严重感染。造模前小型猪平均体质量为(27.0±1.31)kg，造模后第5、20周造模小型猪平均体质量分别为(28.1±2.41)、(29.5±1.78)kg，造模小型猪造模前后体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模第5周开始出现夜间咳嗽、呼吸困难等症状。

2.2造模小型猪肺组织及心脏细胞病理学改变 第5周末造模小型猪肺组织表面见血点、肺表面凹凸不平，HE染色发现造模小型猪第5周末肺组织内肺泡扩大，肺泡壁断裂，肺间隔水肿；造模第20周对死亡小型猪心脏组织进行HE染色发现右心室心肌细胞肥大，乳头肌肥大，见图1、2。

A：大体观察造模小型猪双肺有陈旧性出血点，肺表面凹凸不平；B：外周肺泡间隔破坏，肺泡腔明显扩大

A：局部心肌细胞肥大；B：横断面示心肌细胞增粗

2.3造模小型猪肺功能指标变化 造模第5、20周末肺功能与造模前小型猪肺功能比较，造模小型猪造模后TLC、FRC、Ri、Re均较造模前升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、2。

表1 造模小型猪造模前与造模第5周末肺功能比较

表2 造模小型猪造模前与造模第20周末肺功能比较

2.4造模小型猪右心功能指标变化 造模小型猪造模第20周右心室舒张末期容积减小、右心室射血分数较造模前降低，右心室舒张末期质量较造模前增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 造模小型猪造模前与造模第20周末右心室结构及功能比较

3 讨 论

COPD是引起肺心病的最常见的原因，其导致原发性肺心病的病理生理学机制主要为：COPD导致的人体缺氧，继发肺小血管收缩、痉挛、肺小动脉阻力增加，引起右心后负荷增大、右心室肌肥大，最终导致右心心力衰竭发生[1,6]。目前的研究认为早期发现COPD继发肺动脉高压后右心结构及功能的改变，有助于早期治疗方案的确定[7-8]；同时COPD合并早期肺心病动物模型的建立对疾病的发病机制及诊疗方式的探讨，以及新药的开发有着非常重要的作用。目前木瓜蛋白酶能诱导COPD模型已经被证实，但是其造模所用的动物均为鼠、兔等小动物，缺乏COPD继发早期肺心病的大型动物造模研究，大型动物的造模有助于外科手术治疗及治疗后应用无创性检查仪器进行疗效观察研究[9]。

本实验采用木瓜蛋白酶联合胰蛋白酶诱导小型猪COPD继发早期肺心病的实验模型[10]。气管内注入木瓜蛋白酶，会引起小型猪肺泡腔扩大，肺泡间隔断裂的肺气肿征象，同时联合胰蛋白酶能使肺内弹性蛋白酶/抗弹性蛋白酶系统失衡、激活肺组织内弹性蛋白酶活性，另外胰蛋白酶还能分解肺内的弹性蛋白、纤维粘连蛋白，使肺的弹性功能降低、顺应性减低，导致呼气性呼吸困难，加速COPD进展[11]。本实验同时也证实木瓜蛋白酶联合胰蛋白酶诱导小型猪COPD模型是可行的。本研究期望降低小型猪COPD的建模时间，反复向小型猪气管内注入木瓜蛋白酶及胰蛋白酶，但是出现明显功能受损是在第5周，这可能与小型猪、犬类等大型动物肺体积较大，以及肺组织发育较为完善有关[12]。随着造模时间的推移，造模小型猪的肺功能受损更加严重，第20周末小型猪Re较造模第5周末明显增加。这说明支气管、肺组织反复发生炎症损伤，以及持续的外基质的沉积，加重了肺实质结构的破坏及纤维化[13-14]。

COPD逐渐进展导致的肺动脉压力增高，继发右心室后负荷增大，最终导致肺心病及右心心力衰竭[15]。早期发现、监测、随访COPD患者右心室结构及功能的改变对于COPD的治疗有着非常重要的作用。小型猪的心脏结构与人类类似，也利于治疗后体外的随访观察，成为COPD合并早期肺心病动物模型的首选。本实验发现：小型猪在造模第20周末右心室舒张末容积降低，心肌肥大，右心室舒张末期质量增加，右心室射血分数降低，这符合人类COPD合并早期肺心病的病理表现。随着COPD的进展，肺动脉压力增大、右心后负荷增加，为保证右心射血功能正常，右心心肌出现代偿性肥大，早期右心室容积缩小，随后容积增大，心脏失代偿，发生右心心力衰竭[16]。同时，本实验也采用无创性体外检查技术来监测右心室结构及功能变化，减轻了实验动物的伤害，也同时为后续疾病的治疗、随访提供了新的思路与方法。

综上所述，木瓜蛋白酶联合胰蛋白酶可诱导小型猪COPD合并早期肺心病模型的建立，能够展现COPD及早期肺心病的特征，可以为进一步治疗和预防COPD合并早期肺心病的研究提供一定的基础。