前体代谢工程提高红霉素产量的研究进展

张万祥，汪焰胜，吴杭，张部昌

安徽大学a.物质科学与信息技术研究院；b.生命科学学院；安徽 合肥230601

糖多孢红霉菌是革兰阳性放线菌，常用于大规模生产红霉素[1]。红霉素是抗革兰阳性菌广谱抗生素,自1952年首次分离问世后，一直占据主流医药市场[2]。为增强红霉素对胃酸的稳定性并克服细菌的耐药性，通过对红霉素结构进行修饰，产生了以克拉霉素为代表的第二代红霉素和以泰利霉素为代表的第三代红霉素[3]。红霉素在抗生素类药物领域表现出惊人的经济价值和巨大的新药开发潜能[4]，这使得提高红霉素产量的研究显得尤为重要。

为提高红霉素产量，满足市场需求，近年来各项研究层出不穷，但高产菌株的筛选策略通常有2种：一是经典菌株随机突变筛选，这种方法通常需要多次随机突变，耗时耗力；二是理性基因工程改造[5-6]。前体是次级代谢生产的决定性因素之一[7]，通过增加前体供应，改变前体代谢流向，是提高次级代谢产物的重要思路。

自Thompson等[8-9]首次从糖多孢红霉菌中克隆出红霉素抗性基因ermE开始，红霉素生物合成通路逐渐被解析清楚。2004年Lum等[10]发现红霉素高产与前体代谢调控有关，通过增加红霉素前体供应和对相关的转录调控因子进行改造能够提高红霉素产量。我们针对前体代谢工程改造，综述了近年来有关提高红霉素产量的研究进展。

1 红霉素A生物合成途径

红霉素A生物合成途径的解析是利用代谢工程提高红霉素产量的前提。红霉素的生物合成分为2个阶段，即聚酮骨架的合成和后修饰阶段。以1分子丙酰辅酶A为起始单元，6分子甲基丙二酰辅酶A为延伸单元，经Ⅰ型聚酮合酶（polyketide synthaseⅠ，PKSⅠ）催化合成6-脱氧红霉素内酯B（6-deoxyerythronolide B，6-dEB）；在EryF、EryBⅤ、EryCⅢ/EryCⅡ作用下依次发生羟基化、糖基化生成红霉素内酯B（erythronolide B，EB）、3-O-mycarosl-红霉内酯B（3-O-mycarosylerythronolide B，MEB）和第一个具有生物学活性的红霉素D。红霉素D到红霉素A有2条途径：一是先在EryG作用下甲基化生成红霉素B，再经EryK羟基化生成红霉素A；另一条途径是在EryK的作用下羟基化生成红霉素C，再经EryG甲基化生成红霉素A[11-13]。红霉素A生物合成模型的建立为前体代谢的研究奠定了基础，其合成通路上前体的代谢改造对红霉素合成具有重要影响。

2 前体喂养途径

丙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A是红霉素合成的重要前体，增加其含量是提高红霉素产量的重要策略[7,14]。GlnR家族多效性调控因子DasR的缺失会引起SACE_1456-1459、SACE_5638-5640的转录水平显著下调，从而使丙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A的合成水平降低，最终导致红霉素产量下降[15]。研究表明，体外补充正丙醇能够增加甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A含量，最终导致红霉素产量上升[14,16]。

2.1 丙酰辅酶A喂养途径

奇数或分支脂肪酸的β氧化产物是丙酰辅酶A的一部分来源[17]。比较转录组学分析发现，工业高产菌株E3相比NRRL23338，表现出对脂肪酸分解途径的激活作用，参与脂肪酸分解代谢上调的基因有SACE_4038、SACE_4125、SACE_4571、SACE_6363等[18]。与之对应，在培养基中添加油脂能提高红霉素产量[19-20]。

分支氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）的降解也是丙酰辅酶A的一部分来源[21-22]，因此针对分支氨基酸降解途径酶基因和相关调控因子的改造是一条重要思路。比较转录组分析发现，分支氨基酸分解途径中编码一些关键酶的基因如SACE_4125、SACE_4571、SACE_4570、SACE_4672等在工业菌株E3中显著上调[18]。

糖多孢红霉菌中过表达与分支氨基酸相关的3个基因/操纵子ilvB1（SACE_4565）、bdkOp（SACE_3952）和mmsOp1（SACE_1456-59），分别导致红霉素产量提高74%、67%和250%[23]。在利福平抗性基因rif缺失突变株中发现缬氨酸分解途径的SACE_1456-1459基因显著上调，从而导致红霉素产量上升约4倍[24]。2017年本实验室在糖多孢红霉菌中发现lrp（SACE_5388）的敲除会导致分支氨基酸ABC转运蛋白（SACE_5387-5386）转录水平提高，在A226中过表达SACE_5387-5386导致红霉素产量上升31%。体外分别添加缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，红霉素A产量相应提高47%、35%和16%[25]。Xu等[22]发现PccD能直接作用在参与分支氨基酸降解的bkd操纵子（SACE_3880-3884）上，敲除pccD能使bkd操纵子转录水平上调5倍，过表达bkd操纵子红霉素产量提高38%。

除分支氨基酸外，其他一些氨基酸降解也能产生丙酰辅酶A，如甲硫氨酸[17]、天冬氨酸、苏氨酸[26]等。Clelia等[27]发现通过缺失参与嘌呤嘧啶及硫胺素合成的一些关键酶的编码基因purF（SACE_7125）、purH（SACE_6664）、thiO（SACE_0506）、thiC（SACE_0511）、pyrC（SACE_2080），可改变代谢流，提高丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸的代谢，进而提高丙酰辅酶A含量。吕伟等[28]在发酵培养基中添加天冬氨酸导致红霉素A产量上升。

2.2 甲基丙二酰辅酶A喂养途径

在链霉菌中发现至少4条途径与甲基丙二酰辅酶A合成有关：丙酰辅酶A羧化酶（proprionyl-CoA carboxylase，PCC）途径（羧化丙酰辅酶A生成甲基丙二酰辅酶A）、甲基丙二酰辅酶A变位酶（methyl⁃malonyl-CoA mutase，MCM）途径（催化琥珀酰辅酶A与甲基丙二酰辅酶A的可逆异构化）、源于乙酰辅酶A的MeaA途径[29]和巴豆酰辅酶A还原酶（crotonyl-CoA reductase，CCR）途径[30]，但在糖多孢红霉菌中只发现PCC和MCM途径[18,21,31]。

2.2.1 PCC途径丙酰辅酶A不仅是红霉素的起始单元，也是甲基丙二酰辅酶A的前体[21,32]。丙酰辅酶A的吸收在微生物中有2条途径：一是经过甲基柠檬酸途径（methylcitrate cycle，MCC）转化成丙酮酸；二是通过PCC途径催化丙酰辅酶A生成甲基丙二酰辅酶A。糖多孢红霉菌基因组中没有发现编码MCC途径相关酶的基因[21,33-34]。糖多孢红霉菌的这种代谢模式可能有利于丙酰辅酶A转化成甲基丙二酰辅酶A，继而有利于红霉素的合成。

基因组测序分析表明，糖多孢红霉菌中至少存在6个编码PCC的区域（SACE_0026-0028、SACE_3241-3242、SACE_3398-3400、SACE_3856/6509、SACE_4237、SACE_7038-7039）[21,31]，目 前只有SACE_4237和SACE_3398-3400被报道。比较转录组分析发现，SACE_4237在红霉素高产菌株E3中的转录水平明显比NRRL23338高，表明红霉素高产可能与SACE_4237这一PCC编码基因的高表达有关[18]。2017年Xu等[21]发现TetR家族转录调节子PccD（SACE_3396）能够直接抑制pccB（SACE_3398）、pccC（SACE_3399）和pccA（SACE_3400）的转录，且发现甲基丙二酸能够作为效应分子解除PccD对pccBC的结合作用，在糖多孢红霉菌中敲除pccD促进丙酰辅酶A转化成甲基丙二酰辅酶A从而导致红霉素产量上升。

2.2.2 MCM途径糖多糖红霉菌中MCM途径的一个关键酶MutB可催化琥珀酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A的可逆转化，且其催化方向受培养基的影响：在油基培养基中，催化方向向甲基丙二酰辅酶A，有利于红霉素的合成；在可溶性碳水化合物培养基中，催化方向向琥珀酰辅酶A，进入TCA循环[35-36]。因此，通过基因工程手段将整个MCM操纵子整合到糖多孢红霉菌染色体上并在油基培养基条件下可以促进琥珀酰辅酶A转变成甲基丙二酰辅酶A，最终提高红霉素产量[37]；而在可溶性碳水化合物基质培养基中，mutB敲除突变株的红霉素产量较出发菌株提高约126%[36]。值得注意的是，琥珀酰辅酶A经MutB催化生成的是（2R）-甲基丙二酰辅酶A，须通过MCM途径中的异构酶（如SACE_6238）异构化产生（2S）-异构体，虽然目前还没有关于该酶的研究报道[18]。

3 糖基化修饰改造

红霉素A的大环内酯骨架上C-3和C-5位置附着2个脱氧糖，糖基的存在对红霉素的生理活性与生物合成产量至关重要[38]。增加糖基供应是提高抗生素产量的一个重要方向，如在井冈霉素生物合成中发现，添加高浓度的UDP-葡萄糖（井冈霉素糖基供体）或超量表达UDP-葡萄糖焦磷酸化酶均能提升其产量[39]。糖多孢红霉菌在糖基化方面的研究多集中在红霉素衍生物方面，对于红霉素产量方面的研究较少。本实验室发现来自委内瑞拉链霉菌的糖基转移酶DesⅦ/DesⅧ不仅能够替代EryCⅢ的功能，在MEB的C-5位置上连接D-德糖胺，而且具有比EryBⅤ更高的效率催化L-霉菌糖连接到EB的C-3位置上，在eryBV基因缺失突变株中异源表达DesⅦ/DesⅧ，可提高红霉素的产量[40]。

4 甲基化修饰改造

红霉素B和C是红霉素A的直接前体，可分别被EryK和EryG催化形成红霉素A。EryK/EryG的平衡对红霉素的生物合成效率有重要影响。Chen等[13]通过优化eryK/eryG拷贝数比例（3∶2），显著提高红霉素产量与纯度。

EryG是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethio⁃nine，SAM）依赖型的甲基化酶，增加甲基化反应的底物（SAM）浓度能够提高催化效率使红霉素产量上升[41]。SAM合成酶（SAM synthetase，MetK）可催化L-甲硫氨酸和ATP形成SAM。添加外源SAM或过表达metK可提高相应次级代谢产物产量[42-43]。在糖多孢红霉菌基因组中整合来自壮观链霉菌的metK，红霉素A产量上升132%；添加外源SAM也可提高红霉素产量[41]。在大肠杆菌BAP1（pBP130/pBP144）中共表达metK可使红霉素母环6-脱氧红霉素内酯B的产量提高约85%[12]。本实验室在糖多孢红霉菌野生菌株和工业菌株中分别串联过表达metK、透明颤菌血红蛋白基因vhbS和全局性调控基因adpA，均可显著提高红霉素产量[44]。

5 结语

增加前体供应和提高红霉素生物合成通路中相应酶活是提高红霉素产量的重要策略。目前这些研究已取得一定进展，但仍具有挖掘的潜力。红霉素合成通路涉及多种前体代谢，然而目前这些前体供应通路仍有不清晰之处。丙酰辅酶A的来源，除了本文中论述的脂肪酸和氨基酸，还有其他来源有待深入研究，如胆固醇的降解[17,45-46]等；糖多孢红霉菌中，甲基丙二酰辅酶A的供应未发现MeaA和CCR通路[18,21,31]，是否存在其他替代路线？这些均是值得深入探讨的问题。

红霉素合成过程涉及多种酶，但对这些酶进行改造以提高红霉素产量的研究较少。通过改造酶的活性位点或增加相应的辅因子提高催化效率，也是提高红霉素产量的重要思路。

此外，糖多孢红霉菌中初级代谢与次级代谢的平衡也有待研究。葡萄糖作为碳源参与糖多孢红霉菌的初级代谢，过量添加葡萄糖却导致次级代谢产物红霉素产量下降，同时正丙醇和豆油等有利于次级代谢的底物利用率下降[16,20]。这表明，初级代谢与次级代谢并不是相互独立的，它们之间的平衡对红霉素等的次级代谢合成具有重要影响。针对初级、次级代谢平衡的研究，对提高红霉素产量具有重要意义。