明党参中游离氨基酸与核苷类成分的同时测定及品质评价

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(1.常州市中医医院,江苏常州 213003; 2.南京中医药大学药学院,江苏南京 210023)

明党参(ChangiumsmyrnioidesWollf)是我国华东地区特有的伞形科多年生草本植物[1-2]。其根部经烫煮、去皮等处理后即为药材明党参,可用于治疗肺热咳嗽、呕吐反胃、食少口干、目赤眩晕、疔毒疮疡等症[3];除药用外,亦常作滋补品食用[4]。明党参药材及植株各部位含有挥发油、多糖、不饱和脂肪酸、香豆素、胆碱等多种化学成分,具有增强免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗凝血等药理作用[5-8]。其中,氨基酸和核苷类物质与明党参补益功能相关,可为生命活动提供营养,许多成分如精氨酸、鸟苷、腺苷等,又具有抗疲劳、调节免疫、调节心血管系统等药理作用[6,9],此外,味觉氨基酸还影响明党参的呈味。

国内外研究主要采用高效液相色谱法、全自动氨基酸分析仪法和液相色谱-质谱联用法测定氨基酸含量[10-16]。其中高效液相色谱法可利用紫外检测器直接检测,但需先进行柱前衍生化处理。全自动氨基酸分析仪具有较固定的测定规程,但周期相对较长,一般需50 min以上。液相色谱-质谱联用法测定快速、便捷,但需根据具体样品调整色谱和质谱条件。核苷类成分主要采用高效液相色谱法测定,多以甲醇-水、甲醇-磷酸或乙腈-甲酸为流动相[17-19]。前期研究仅对明党参新鲜根部和炮制品中氨基酸含量进行测定,已测得18种游离氨基酸[11-13],但尚未对根以外部分及组织培养材料进行研究,亦未见对其中核苷类成分的研究报道。

本实验结合预实验选取已报道的18种游离氨基酸中人体蛋白质组分氨基酸和药用氨基酸共计11种为游离氨基酸测定指标,同时,选取11种与生命代谢和发挥药理作用相关的常见核苷与碱基作为核苷类测定指标。本研究运用超快速液相色谱-四极杆离子阱质谱联用法(UFLC-Qtrap-MS/MS)同时、快速检测明党参叶、柄、根以及组织培养物中11种游离氨基酸和11种核苷类成分,从游离氨基酸与核苷角度揭示不同样品的品质差异,为进一步合理利用明党参资源提供启示与参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明党参植株 采集于南京中医药大学仙林校区药苑,分拣出叶、柄和根;明党参组织培养材料 获取自前期实验[20-21],其中再生小植株先由愈伤组织诱出丛生芽[22],再在含1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤的培养基上继代一次后转至含1.0 mg/Lα-萘乙酸的培养基上诱导生根而得,收获小植株并分拣出叶、柄和根;11种氨基酸和11种核苷对照品:脯氨酸(批号:B21914)、缬氨酸(批号:B21936)、亮氨酸(批号:B21925)、天冬氨酸(批号:B21934)、谷氨酸(批号:B21916)、赖氨酸(批号:B21922)、甲硫氨酸(批号:B21913)、组氨酸(批号:B21938)、苯丙氨酸(批号:B21910)、精氨酸(批号:B21920)、酪氨酸(批号:B21924)、尿嘧啶(批号:100469-200401)、腺嘌呤(批号:110886-200001)、次黄嘌呤(批号:B20211)、鸟嘌呤(批号:140631-200904)、胸苷(批号:1001182663)、胞苷(批号:100982718)、尿苷(批号:887-200202)、2′-脱氧鸟苷(批号:1000943454)、腺苷(批号:110879-200202)、肌苷(批号:40669-201104)、鸟苷(批号:1001103046) 纯度均大于98%,上海源叶生物科技有限公司;甲酸 色谱纯,德国默克公司;乙腈 色谱纯,德国默克公司。

ABSciex QTRAP 5500质谱仪 美国ABSciex公司;LC-20A快速液相仪 日本岛津公司;BT125D十万分之一电子天平 德国赛多利斯公司;ME36S百万分之一电子天平 德国赛多利斯公司;KH-500DB数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;TGL-16B型离心机 上海安亭科学仪器厂;FD-1A-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;Milli-Q Direct 8超纯水仪 德国默克密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液制备 精密称取22种对照品,用纯水配制成对照品母液。精密吸取各母液2 mL,用纯水定容至50 mL,得到混合对照品母液,其中各对照品浓度见表2。

1.2.2 供试品溶液制备 明党参样品经冷冻干燥,研粉,过四号筛,称取样品粉末1.0000 g,置50 mL锥形瓶,加20 mL超纯水,于室温下超声(100 kHz)提取1 h,过滤,滤液在12000 r·min-1离心10 min,取上清液1 mL,加超纯水定容至10 mL,过0.22 μm微孔滤膜后备用。

1.2.3 色谱条件 采用Waters XBridge Amide(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)色谱柱,流动相为0.2%甲酸(A)-0.2%甲酸乙腈溶液(B)梯度洗脱(0～2.5 min,15% A;2.5～5 min,15～50% A;5～7 min,50% A;7～8 min,50～15% A;8～11 min,15% A)[19]。流速为0.6 mL·min-1,进样量为2 μL,柱温为30 ℃。

1.2.4 质谱条件 采用电喷雾离子源,多反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM)进行正离子检测,气帘气压35 psi,Gas1气压55 psi,Gas2气压55 psi,温度550 ℃,喷雾电压为5500 V。

1.2.5 标准曲线、检测限和定量限 取1.2.1项下混合对照品母液,逐级稀释成一系列混合对照品溶液,分别过0.22 μm微孔滤膜后备用。精密吸取不同浓度的混合对照品溶液分别于1.2.3和1.2.4项所述色谱-质谱条件下测定,以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归,确定回归方程、相关系数和线性范围,检测限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)分别取信噪比S/N=3和S/N=10进行计算。

1.2.6 方法学考察

1.2.6.1 精密度考察 取混合对照品溶液,于1.2.3和1.2.4项所述色谱-质谱条件下连续进样6次,计算各成分6次峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.6.2 重复性考察 称取6份明党参样品(A1),按1.2.2项所述制备成供试品溶液,在1.2.3和1.2.4项所述色谱-质谱条件下测定,以峰面积计算6份样品测定结果RSD值。

1.2.6.3 稳定性考察 称取明党参样品(A1),按1.2.2项所述制备成供试品溶液,在1.2.3和1.2.4项所述色谱-质谱条件下,于0、2、4、8、12、24 h分别进样测定,以峰面积计算6个时间点测定结果的RSD值。

1.2.6.4 加样回收率考察 称取明党参样品(A3),精密加入高、中、低3个水平的对照品,每一水平3次重复,共9份。按1.2.2项所述制备供试品溶液并在1.2.3和1.2.4项所述色谱-质谱条件下进样测定,以峰面积计算回收率及RSD值。

1.2.7 明党参样品测定 将明党参样品按1.2.2项所述制成供试品溶液,于1.2.3和1.2.4项所述色谱-质谱条件下进样测定,每一样品重复3次。

1.3 数据处理

根据线性关系计算样品中氨基酸和核苷类成分含量,利用Excel统计样品中测得的游离氨基酸和核苷类成分总数量与总含量、人体必需氨基酸数量和味觉氨基酸含量,并进行逼近理想点排序(technique for order preference by similarity to an ideal solution,TOPSIS)。应用SPSS Statistics 22.0分别进行样品中氨基酸和核苷类成分的主成分分析(principal component analysis,PCA)。

2 结果与分析

2.1 色谱-质谱条件优化结果

预实验对色谱柱温(27、30、35 ℃)、流动相流速(0.4、0.6、0.8 mL·min-1)和质谱MRM参数进行了考察,结果表明柱温30 ℃,流动相流速0.6 mL·min-1时各成分分离效果最佳,各成分保留时间和优化后的MRM参数见表1。

表1 待测成分保留时间和MRM参数Table 1 Retention time and MRM parameters of component to be tested

续表

2.2 标准曲线、检测限和定量限

22种待测成分线性回归方程、线性范围、相关系数、检测限和定量限见表2,各成分在各自线性范围内线性关系良好,相关系数均不低于0.9973,表明所得标准曲线可靠。

表2 待测成分标准曲线、检测限和定量限Table 2 Standard curves,LOD and LOQ of component to be tested

2.3 方法学考察

本实验所建方法的精密度、重复性、稳定性和加样回收率考察结果见表3,RSD值均小于5%,回收率均在98.62%～100.64%之间,表明仪器精密度、方法重复性和待测成分稳定性良好,该测定方法准确可靠。

表3 方法学考察结果Table 3 Results of methodological evaluation

2.4 氨基酸类成分分析

2.4.1 氨基酸总含量与种类分析 实验测得明党参样品中游离氨基酸种类及总含量分别如图1和图2所示。原植物叶、柄、根和再生植株叶、柄中氨基酸种类较多,说明该类成分随着细胞分化程度的增高而积累。但再生根中种类较少,仅检出3种,相比原植物根大大减少,这可能由两者结构、功能上的差异所致。氨基酸类成分组成及含量见表4。栽培品多年生根外形膨大,为重要的营养储藏器官,检出5种人体必需氨基酸,而组培再生根较细弱,主要发挥固着植株和吸收营养的功能。游离氨基酸总含量的最低值(叶愈伤组织)和最高值(叶柄悬浮细胞)均存在于脱分化状态的培养样品中。该类成分在植物体内既是营养物质,又在某些条件下发挥渗透调节功能,如脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酸等[23-25],悬浮细胞在液体培养基中培养,相较于愈伤组织其环境渗透压改变较大,细胞相应产生更多渗透调节物质,这可能是导致该样品游离氨基酸总量高的原因之一。

图1 明党参样品中氨基酸类成分种类Fig.1 Total numbers of amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples注:A1-原植物叶;A2-原植物柄;A3-原植物根;B1-再生植株叶;B2-再生植株柄;B3-再生植株根;C1-叶源愈伤组织;C2-柄源愈伤组织;D1-叶源悬浮细胞;D2-柄源悬浮细胞；图2～图5同。

图2 明党参样品中氨基酸类成分总含量Fig.2 Total contents of amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples

表4 样品中氨基酸类成分含量(μg·g-1)Table 4 Contents of amino acids in samples(μg·g-1)

2.4.2 氨基酸类主成分分析 明党参各样品中游离氨基酸含量经降维分析,以特征值>1,方差贡献率>5%,累积贡献率>70%为标准,选取了4个主成分(表5),累计贡献率为86.888%,各主成分对氨基酸指标的载荷和评分系数见表6。F1主要反映谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和组氨酸信息,F2反映甲硫氨酸和亮氨酸含量,F3代表苯丙氨酸和天冬氨酸,F4代表酪氨酸和缬氨酸。计算四个主成分得分并进一步通过各自方差贡献率的权重计算出各样品中氨基酸类成分的综合评分F值,F=0.404F1+0.258F2+0.187F3+0.151F4(表7)。评价结果显示,以游离氨基酸为指标,明党参栽培品根品质最佳,其次为离体培养再生叶。

表5 氨基酸类主成分特征值和方差贡献率Table 5 Eigenvalue and variance contribution rate of principal components of amino acids

表6 氨基酸类主成分载荷和评分系数Table 6 Factor load and score coefficient matrix of principal components of amino acids

表7 氨基酸类主成分得分和综合评价Table 7 Principal component score and comprehensive evaluation of amino acids

2.4.3 味觉氨基酸分析 将明党参样品中的氨基酸归为甜、苦、鲜和芳香四类[26-27],其分布如图3所示。四类味觉氨基酸在不同样品中含量差异较大,其中,原植物叶和柄悬浮细胞中四者分布较为均衡,其余离体培养样品大多缺失一些类别的味觉氨基酸。原植物根中含较多苦味和甜味氨基酸,是药材明党参“味甘、微苦”[3]的物质基础之一。甜味、鲜味和芳香类氨基酸最高含量均存在于柄悬浮培养细胞中,该培养材料生长状况也较为旺盛[20],提示着其为味觉氨基酸的一种可利用资源。再生叶和柄中含有较多的甜味及苦味氨基酸。明党参由于种子萌发率低、自然竞争力较弱等原因导致其实生苗较难获得[28-30],而组培再生芽易于获得,具有一定的芽菜开发价值。

图3 明党参样品中味觉氨基酸含量Fig.3 Contents of taste-active amino acids in Changium smyrnioides Wollf samples

2.5 核苷类成分分析

2.5.1 核苷总含量与种类分析 明党参样品中测得核苷类成分总数量与总含量分别如图4和图5所示,核苷类成分具体含量见表8。分化器官中核苷种类数总体稍稍多于脱分化样品,其中以原植物叶中种类最多,但核苷类总含量方面呈现出相反趋势,脱分化细胞中总含量高于分化器官,其中柄悬浮培养细胞中总含量最高,说明脱分化培养状态虽然可能缺失对个别核苷类成分如次黄嘌呤、腺嘌呤的积累,但利于其他核苷成分如鸟苷、腺苷的大量积累。该类成分多具有抗菌、抗肿瘤、免疫调节、镇静等药理作用[9,18],提示着明党参愈伤组织、悬浮细胞等脱分化的培养材料为此类成分的潜在资源。

表8 样品中核苷类成分含量(μg·g-1)Table 8 Contents of nucleosides in samples(μg·g-1)

图4 明党参样品中核苷类成分种类Fig.4 Total numbers of nucleosides in Changium smyrnioides Wollf samples

图5 明党参样品中核苷类成分总含量Fig.5 Total contents of nucleosides in Changium smyrnioides Wollf samples

2.5.2 核苷类主成分分析 明党参样品中核苷类成分含量经降维分析,以特征值>1,方差贡献率>5%,累积贡献率>70%为标准,选取了3个主成分(表9),累计贡献率为85.001%,各主成分对核苷类指标的载荷和评分系数见表10。F1主要反映鸟苷、鸟嘌呤、尿苷、尿嘧啶和腺苷的信息,F2主要代表2′-脱氧鸟苷、肌苷、腺嘌呤和胸苷,F3代表胞苷。计算三个主成分得分,并进一步算出10种样品中核苷类成分的综合评分F值,F=0.467F1+0.338F2+0.195F3(表11)。结果显示,以核苷类成分为指标,明党参柄悬浮培养细胞品质最佳,其次为原植物叶。结合表8可见,F1中的腺苷与鸟苷含量在所有样品中均明显高于其他成分,腺苷具降血压、抗血小板聚集、镇静中枢神经、调节睡眠等功能[31-32],鸟苷具免疫调节、防心律失常、改善心脑血液循环等作用[9,33],柄悬浮细胞中这两者含量也尤为突出,可结合发酵工程以积累腺苷与鸟苷成分为目标对该悬浮培养体系进一步研究。原植物叶为药材采收时被大量废弃的部分,亦可作为核苷类资源合理利用。

表9 核苷类主成分特征值和方差贡献率Table 9 Eigenvalue and variance contribution rate of principal components of nucleosides

表10 核苷类主成分载荷和评分系数Table 10 Factor load and score coefficient matrix of principal components of nucleosides

表11 核苷类主成分得分和综合评价Table 11 Principal component score and comprehensive evaluation of nucleosides

2.6 基于TOPSIS法的综合评价

表12 明党参样品TOPSIS分析结果Table 12 Result of TOPSIS evaluation for Changium smyrnioides Wollf samples

3 结论

本研究建立了以UFLC-Qtrap-MS/MS同时检测明党参原植物及其组培样品中11种游离氨基酸与11种核苷类成分的方法。22种成分在一定浓度范围内线性关系良好,精密度、重复性、稳定性和回收率考察RSD值均小于5%,平均加样回收率在98.62%～100.64%之间,表明该测定方法准确可靠,可供明党参中11种游离氨基酸与11种核苷的同时、快速测定。

不同状态的明党参样品中游离氨基酸与核苷类成分有一定差异。原植物和再生植株中成分种类较多,而悬浮细胞中总含量较高。柄悬浮细胞中所测11种游离氨基酸与11种核苷总含量均为最高,分别为3682.01、6241.90 μg·g-1,该样品中味觉氨基酸含量丰富,其中甜味和鲜味氨基酸含量也居所有样品首位。主成分分析显示以游离氨基酸为指标,原植物根品质最佳,其次为再生叶;以核苷类成分为指标,柄悬浮细胞品质最佳,其次为原植物叶。TOPSIS法综合两类成分进行评定认为柄悬浮细胞最优,其次为原植物根。由此可见,明党参传统药食两用的根部、被废弃的叶片和利用组培技术获得的再生叶、柄悬浮细胞均具有与氨基酸和核苷相关的开发价值,该结果为明党参资源的合理利用提供参考。