不同暂养添加物对Cd2+胁迫的紫贻贝机体免疫功能的调节作用

邱愚蘅,孙孟辉,王 欣,张 宾

(浙江海洋大学食品与医药学院,浙江舟山 316022)

紫贻贝(Mytilusedulis)俗称淡菜、海虹,是我国主要的经济养殖贝类,具有味道鲜美、营养丰富等特点,而深受国内外消费者的欢迎。近年来,贻贝等双壳贝类水产动物的暂养,已由原先的大水体、低密度的粗放型暂养,转变为小水体、高密度的集约化暂养,由此而带来的是水产动物免疫机能下降较快和感染各种疾病、病毒的危险性增加[1]。在双壳贝类水产动物暂养(或养殖)过程中,使用抗生素进行病害防治,会导致大量抗药性细菌产生,并对环境造成残留污染,给人类食品安全性带来隐患[2]。使用绿色免疫调节剂,可有效改善水产动物的免疫机能和对外界恶劣环境的抗逆性。但是,目前贻贝类水产动物的免疫调节剂研究,还面临诸多问题待解决,如免疫调节剂种类较少、使用剂量差别较大、作用效果较为有限等。

重金属镉(Cd2+)作为环境中常见的污染物,是已知生物体内最易积累的毒物之一,已被美国毒理管理委员会列为第6位危及人体健康的有毒物质。近年来,工业“三废”的排放、含重金属农药和化肥的不合理使用,使得大量金属元素特别是人体非必需的重金属,通过各种途径进入地表水。甲壳类水产动物是对重金属富集能力最强的水生动物类群之一。从单次污染指数及污染物负荷比来看,Cd2+对贻贝类的生理机能影响最大。低剂量的Cd2+在贻贝机体内不断富集,对其免疫防御系统造成严重的损害,导致其抗病力下降,甚至大批量的死亡[3]。目前,关于Cd2+在贻贝类机体组织中的生物富集、毒害作用及对相关保护酶活性变化情况等,国内外已有不少研究及报道[4-6],而有关Cd2+污染胁迫后紫贻贝机体的免疫调节及恢复作用研究,国内外还鲜见报道。课题组前期研究发现,采用60和120 mg/L硒化卡拉胶、160 mg/L EDTA-CaNa2和500 mg/Lβ-葡聚糖添加物饲喂,对暂养紫贻贝体内Cd2+具有良好的脱除效果,其脱除率分别为43.6%、37.2%、41.6%和44.6%。课题组前期仅对不同添加物对紫贻贝体内Cd2+脱除效果进行了探索,而对饲喂紫贻贝机体状态及非特异性免疫情况,没有进行深入分析。本研究在前期研究基础上,重点探索不同的暂养添加物对紫贻贝不同组织中抗氧化保护酶活力的影响情况,旨在找出一种有效的紫贻贝机体免疫调节剂及其应用方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

活体紫贻贝(Mytilusedulis) 壳长为(9.0±0.5) cm,壳宽为(4.0±0.3) cm,壳高为(7.0±0.4) cm和体重为(56.0±3.4) g,购于舟山市东河鲜活水产品市场;养殖海水 取自舟山市附近海域,经沉淀、砂滤处理后,进行暂养紫贻贝试验。经前期检测分析,暂养海水中本底Cd2+浓度<0.04 μg/L,pH为7.8～8.0,盐度为29‰～31‰;氯化镉、亚硒酸钠 上海沃凯化学试剂有限公司;硒化卡拉胶(DP 2～20,κ型) 上海甄准试剂有限公司;卡拉胶寡糖(DP 2～10,κ型) 博智汇力生物科技有限公司;螺旋藻藻粉(饲料级) 上海光语生物科技有限公司;肝素钠(MAS) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化氢酶(CAT)和酚氧化酶(PO)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所。

Direct-Q3U型超纯水制备机 美国Millipore公司;MDF-U53V型超低温冰箱 日本SANYO公司;Tube Mill 100 Control型研磨机 德国IKA集团;CF16RN型高速冷冻离心机 日本日立公司;751UVGD型紫外-可见光分光光度计 上海第三分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 紫贻贝暂养 挑选体格健壮、壳色正常及活力旺盛的紫贻贝样品,经海水清洗去除表面附着物后,置于直径100 cm、高60 cm圆柱形聚乙烯桶中,进行适应性暂养。每个养殖桶中添加40 L海水。暂养期间投喂贝类饲料用螺旋藻粉,隔日更换新鲜海水1次,每次换水量为总体积的3/4,24 h持续通氧,水体温度17～18 ℃。每日剔除死亡及活力不强的紫贻贝个体。

1.2.2 Cd2+胁迫紫贻贝 经适应性暂养7 d后,挑选反应灵敏、着丝正常的紫贻贝样品,随机放入养殖桶(30只/桶),添加40 L含0.40 mg/L CdCl2养殖海水,24 h持续通氧,隔日更换含0.40 mg/L CdCl2海水,更换量为海水总体积的3/4。Cd2+胁迫养殖为期7 d,期间仍然投喂螺旋藻粉(为保持贻贝机体活力),每天定期剔除死亡及活力不强的紫贻贝个体。

1.2.3 添加物饲喂处理 经Cd2+胁迫养殖后,将紫贻贝样品随机分为以下各组:正常紫贻贝组(未经Cd2+胁迫的紫贻贝)，Cd2+胁迫紫贻贝组，1.5、3 mg/L亚硒酸钠饲喂组，60、120 mg/L硒化卡拉胶饲喂组，60、120 mg/L卡拉胶寡糖饲喂组。以上各组中,除去正常组外,均为Cd2+暴露胁迫养殖后的紫贻贝样品。

不同添加物饲喂养殖为期15 d,每个养殖桶中添加海水40 L,隔日更换含有相同质量浓度添加物的海水,更换量为海水总体积的3/4。为保持紫贻贝机体的生物活力,添加物饲喂期间仍然投喂螺旋藻粉,每隔5 d取样1次,每次取样5只紫贻贝,用超纯水冲洗干净,解剖后进行组织样品制备及抗氧化酶活力测定。

1.2.4 试验指标测定

1.2.4.1 紫贻贝内脏团匀浆液的制备 将紫贻贝撬开贝壳后,解剖获得完整贻贝肉,分离完整的紫贻贝内脏团组织,滤纸吸干表面水分后,进行称重,精确到0.001 g。将分离的内脏团加入到无菌生理盐水(4 ℃),调节使其终浓度为0.3 g/mL后(便于酶活性测定),低温高速匀浆后,在4 ℃条件下,10000 r/min离心20 min,上清液即为制备的紫贻贝内脏团匀浆液样品。

1.2.4.2 紫贻贝血淋巴的制备 将紫贻贝撬开贝壳后,解剖获得完整贻贝肉,采用滤纸吸干表面水分后,用经MAS抗凝剂预洗过的注射器,于紫贻贝闭壳肌处抽取血淋巴液,立即注入低温离心管中,同时加入等量MAS溶液作为抗凝缓冲液,然后在4 ℃条件下,8000 r/min离心10 min,上清液即为制备的紫贻贝血淋巴样品。

1.2.4.3 酶活性指标测定 采用试剂盒法测定紫贻贝内脏团、血淋巴匀浆液样品中,总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化氢酶(CAT)和酚氧化酶(PO)的活力,测定过程依据试剂盒说明书进行。

1.3 数据处理

以上试验及分析测定,至少3个平行样品,结果为平均值±标准差。数据分析与统计采用SPSS 19.0分析软件进行。

2 结果与讨论

2.1 不同添加物对紫贻贝中T-SOD活力的影响

不同添加物对紫贻贝内脏团、血淋巴中T-SOD活力影响,如表1所示。结果发现,随暂养时间延长,各组紫贻贝内脏团中T-SOD活力均呈显著下降趋势(P<0.05),其原因主要是由于Cd2+暴露胁迫及相对较长时间暂养而导致。暂养15 d后,正常紫贻贝内脏团中T-SOD活力下降28%,Cd2+胁迫紫贻贝组则下降47%,二者差异显著(P<0.05),表明Cd2+的生物富集对贻贝生理功能产生了较大影响。与Cd2+胁迫组相比,亚硒酸钠和低浓度硒化卡拉胶对内脏团中T-SOD活力未产生显著影响(P>0.05)。相比于Cd2+胁迫和正常紫贻组,卡拉胶寡糖和较高浓度硒化卡拉胶对内脏团中T-SOD活力,具有显著恢复作用(P<0.05),其效果显著优于其它各添加物处理组。对血淋巴中T-SOD活力,正常紫贻贝组随暂养时间延长,未发生显著性变化(P>0.05)。对于Cd2+胁迫紫贻贝组,血淋巴中T-SOD活力显著下降(P<0.05),主要是机体内富集的Cd2+对贻贝机体产生较大的氧化胁迫作用,致使机体发生持续性的氧化损伤。亚硒酸钠、硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖,对氧化损伤的紫贻贝血淋巴中T-SOD活力具有显著的恢复效果(P<0.05)。

表1 不同添加物对紫贻贝中T-SOD活力的影响(U/mg)Table 1 Effect of different additives on the activity of T-SOD in Mytilus edulis(U/mg)

SOD是广泛存在于需氧生物体内的一种金属酶,其在机体抗氧化酶类中处于核心地位,具体通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,从而在预防疾病、提高机体免疫力等方面发挥重要作用[7]。对于多数生物体,重金属Cd2+进入机体后,会产生过氧化胁迫作用,诱导机体产生大量自由基,生物体为清除这些自由基,会表现出“毒物兴奋效应”,即刺激SOD活性的短暂升高;但随暴露时间延长,生物体内活性氧超过SOD清除能力时,就会产生“毒物抑制效应”,总体表现为SOD活力先升高后下降的趋势,因此机体中SOD活力大小在一定程度上可反应机体的健康状况[8]。本研究中,卡拉胶寡糖对Cd2+胁迫产生的氧化损伤具有较好的修复作用,其可能与卡拉胶寡糖分子在体内清除自由基活性有关。Yuan等[9]研究表明,由卡拉胶降解制备的卡拉胶寡糖及其衍生物,能显著保护胸腺淋巴细胞免受长波紫外线以及H2O2的损伤,即表现出良好抗氧化作用。此外,卡拉胶寡糖分子上具有多个活性羟基及硫酸基团,其可与Cd2+离子发生螯合作用,而形成较为稳定的配合物。此外,较高浓度硒化卡拉胶也表现出较好的氧化损伤修复作用,其可能来自Se4+离子及卡拉胶的双重作用。研究表明,Se4+在生物体内具有免疫调节、抗氧化等多种生物学活性,其也是生物体内重金属元素拮抗剂,能有效降低金属元素在机体内的积累作用[10]。另一方面,卡拉胶虽具有一定氧化调节作用,但相比于卡拉胶寡糖分子,由于其聚合度较高、分子量相对较大,因此在生物体内吸收利用及抗氧化活性(氧化损伤修复)也会有所降低。综上,采用硒化卡拉胶、卡拉胶寡糖饲喂处理,对于Cd2+胁迫的紫贻贝内脏团和血淋巴中SOD酶活性,具有较好的调节恢复作用。

2.2 不同添加物对紫贻贝中CAT活力的影响

由表2发现,在正常紫贻贝内脏团中,CAT活力随暂养时间延长未发生显著变化(P>0.05)。饲喂第0 d,相比于正常贻贝,Cd2+胁迫贻贝内脏团中CAT活力显著升高(P<0.05),主要是由于Cd2+暴露诱导紫贻贝产生大量活性氧(ROS),诱导机体处于应激状态,从而使CAT等抗氧化酶被激活以抵抗氧化损伤所致;随暂养时间延长,其内脏团中CAT活力显著下降,可能是由于富集Cd2+对贻贝机体产生较强的损伤作用及抑制了CAT活性。相比于Cd2+胁迫紫贻贝组,亚硒酸钠、硒化卡拉胶及卡拉胶寡糖饲喂处理组,均对CAT活性起到显著提升作用(P<0.05);暂养第15 d,硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖对紫贻贝内脏团中CAT活性改善作用明显,显著高于亚硒酸钠处理组(P<0.05)。对于血淋巴中,各紫贻贝处理组CAT活性均呈不断下降趋势,尤其正常紫贻贝经15 d暂养后,CAT活性降低到最低水平,可能是由于紫贻贝经驯化暂养后,逐渐适应了新的外界环境,从而体内的应激水平也逐渐降低。对于饲喂处理组中,以卡拉胶寡糖对紫贻贝血淋巴中CAT活性的维持效果较好,暂养15 d后仍显著优于亚硒酸钠和硒化卡拉胶处理组(P<0.05)。

表2 不同添加物对紫贻贝中CAT活力的影响(U/mg)Table 2 Effect of different additives on the activity of CAT in Mytilus edulis(U/mg)

CAT是一类广泛分布于生物体内的末端氧化酶,功能是催化细胞内H2O2分解为O2和H2O,清除活性氧并减少羟基自由基的形成,其活力高低能反映机体抗氧化系统对外界刺激的总应激能力[11]。研究表明,双壳贝类在不同浓度Cd2+溶液中,不同组织器官中抗氧化酶(如CAT、SOD等)活性变化呈现“诱导-抑制”的变化规律[12]。邓思平等[13]以0.005 mg/L Cd2+暴露养殖尖子蛤发现,Cd2+对蛤鳃中SOD、CAT及GSH-Px活性并无明显影响;当浓度增加至0.5 mg/L时,蛤组织中抗氧化酶活性呈现出明显的时间和剂量依赖关系,且呈先升高后下降的规律。本试验结果与以上报道结果基本一致。此外,对比CAT和SOD分析结果发现,紫贻贝组织中CAT被激活或抑制程度整体略低于SOD变化情况,说明SOD较CAT更加敏感些,其与SOD为机体内首先与ROS发生作用的抗氧化酶的报道相吻合[14]。王宏伟等[15]发现在饲料中添加亚硒酸钠和富硒酵母,可明显提高对硫磷胁迫下中华米虾体内CAT活性,这与本研究中结果相似。综上发现,硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖对紫贻贝组织中CAT活性具有相对较好的修复作用。

2.3 不同添加物对紫贻贝中PO活力的影响

不同添加物对紫贻贝中PO活力影响,如表3所示。结果发现,在整个暂养时间内,正常紫贻贝的内脏团和血淋巴中PO活力,并未呈现出显著变化(P>0.05)。在暂养第5 d后,Cd2+胁迫紫贻贝、亚硒酸钠和硒化卡拉胶处理组紫贻贝内脏团中PO活力均大幅降低(P<0.05),而在随后的5～15 d暂养期内PO活力变化幅度相对较小。暂养15 d,相比于Cd2+胁迫和正常紫贻贝组,卡拉胶寡糖对机体内脏团中PO活力的恢复作用更明显,具有较好提升PO酶活力的作用。对于血淋巴中PO活力变化情况,在0～15 d暂养期内,Cd2+胁迫紫贻贝组呈现逐渐降低的趋势。亚硒酸钠处理组在暂养第5 d时血淋巴中PO活力出现一定的提高,随后PO活力逐渐降低。对于硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖组,在15 d暂养期内血淋巴中PO活力均维持在较高水平,可能是由于硒元素及糖分子可更好地与血细胞上的识别蛋白结合,激活proPO而释放出更多PO,从而起到较好的机体抗氧化作用。

表3 不同添加物对紫贻贝中PO活力的影响(U/mg)Table 3 Effect of different additives on the activity of PO in Mytilus edulis(U/mg)

PO作为一种含铜的抗氧化酶,能够催化单酚羟化成二酚,并把二酚氧化成醌。一般情况下,PO以无活性酚氧化酶原形式,存在于双壳贝类动物的大颗粒血细胞中,机体通过PO原激活系统(proPO)直接参与免疫反应,因此生物体内PO活力变化能较准确地反映机体的免疫能力[5]。Asokan等[16]研究发现,proPO主要存在于紫贻贝血淋巴中,而血细胞中含量要远大于血浆中含量,该结果与本试验中测定结果相一致(血淋巴中PO活力远高于内脏团中)。本研究中,卡拉胶寡糖对于紫贻贝内脏团和血淋巴中PO活性均具有一定的提升作用,其原因可能主要来自于卡拉胶寡糖分子本身良好的抗氧化活性,同时寡糖分子可能对机体PO激活级联反应系统中某些关键因子的激活或信号传导起到了辅助促进作用,该结果对于判断紫贻贝机体免疫机能的变化具有一定参考价值。

2.4 不同添加物对紫贻贝中ACP活力的影响

不同组紫贻贝中ACP活力变化情况,如表4所示。结果发现,在15 d暂养期内,正常紫贻贝内脏团和血淋巴中ACP活力保持相对稳定,未出现显著变化(P>0.05)。对于Cd2+胁迫紫贻贝组,相比于正常组ACP活力显著增加(P<0.05),且在暂养过程中ACP活力整体也保持较为稳定的状态。在饲养10～15 d,亚硒酸钠、硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖组相比于正常紫贻贝组,显著提升了内脏团和血淋巴中ACP活性(P<0.05)。此外,三种添加物的饲喂处理,对紫贻贝组织中ACP活力达到较高诱导值的时间及剂量也有所不同,可能与各添加物对机体免疫机能的影响途径有所不同所致,其影响机制仍需进一步探讨。本实验中,亚硒酸钠虽表现出一定的机体T-SOD活力调剂作用,但考虑其高浓度应用具有副作用,低浓度饲喂控制难度偏大,因此其在紫贻贝暂养过程中用于抵抗重金属胁迫仍具有一定的局限性。

表4 不同添加物对紫贻贝中ACP活力的影响(U/mg)Table 4 Effect of different additives on the activity of ACP in Mytilus edulis(U/mg)

ACP在生物体内作为机体巨噬细胞的标识酶,活性高低反应了巨噬细胞被激活的程度。同时，ACP作为溶酶体的标志性水解酶,其与溶酶体生理功能的正常运转密切相关。在软体动物体内,溶酶体酶一般具有防御和消化的双重作用,能够清除体内氧自由基,其水解作用是生物体攻击异物的主要机制之一[17]。牟海津等[18]研究发现,栉孔扇贝体内ACP的分布,以肝脏中活力最高,血细胞次之。本试验测定结果与牟海津等研究报道相一致。研究表明,Se4+具有较好拮抗Cd2+毒性作用,在机体内具有显著的清除自由基,并提高相关内源保护酶活性,并已在多种水产动物体内得以证实,如罗非鱼[19]、凡纳滨对虾[20]等。本试验中,Se4+可能通过其抗氧化机制,降低Cd2+对紫贻贝机体的氧化损伤作用。对于硒化卡拉胶的生物活性,孙虎山等[21]研究发现硒化卡拉胶可促进栉孔扇贝血细胞中ACP和溶菌酶的形成,还可促进血细胞中的ACP和溶菌酶向血清中释放,从而提高机体血细胞中的ACP活力。由卡拉胶降解制备的卡拉胶寡糖聚合度和分子量均较低,其对多种自由基的清除能力明显优于大分子的卡拉胶,其优良的抗氧化活性已获得证实。

2.5 不同添加物对紫贻贝体内中GSH-PX活力的影响

由表5可知,经过15 d暂养,正常组紫贻贝内脏团和血淋巴中GSH-PX活力基本保持稳定,未表现出显著变化(P>0.05),而Cd2+胁迫紫贻贝组GSH-PX活力随暂养时间延长显著降低(P<0.05)。此外,亚硒酸钠、硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖组,均表现出较明显的GSH-PX活力增强作用。经各处理组紫贻贝体内GSH-PX活力表现出先降低后升高的趋势,尤其在暂养10～15 d期间,机体内GSH-PX活力显著增强(P<0.05)。在暂养10～15 d期间,对于硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖组,高浓度处理组GPx活力增强作用与低浓度组没有显著差异(P>0.05),这可能是由于所选添加物的机体调节效应已达饱和所致。而暂养10 d时高浓度的亚硒酸钠对于提高紫贻贝GSH-PX活力,显著高于低浓度组(P<0.05),其原因可能是由于较高的亚硒酸钠对紫贻贝机体已产生了一定的胁迫刺激效应,而引起了紫贻贝的氧化应激反应,因此较高浓度的亚硒酸钠对于机体的免疫调节可能产生一定的副作用。

表5 不同添加物对紫贻贝中GSH-PX活力的影响(U/mg)Table 5 Effect of different additives on the activity of GSH-PX in Mytilus edulis(U/mg)

GSH-PX广泛存在于生物体内,是机体抵抗氧化应激的第一道屏障。GSH-PX与CAT、SOD以及小分子抗氧化物质(如VC)一起构成抗氧化系统,起到清除体内氧自由基,防止细胞膜与遗传物质损伤的作用[22]。当紫贻贝遭受短时间高浓度或者长时间低浓度重金属污染物胁迫时,体内ROS不断累积超过机体的最大承受量,此时机体生物膜和酶系统被严重破坏。本试验中,硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖对紫贻贝具有较好的GSH-PX酶活力提升作用,可辅助机体抵抗或修复Cd2+胁迫造成的细胞膜氧化损伤作用[23]。从整体来看,硒化卡拉胶和卡拉胶寡糖饲喂紫贻贝后,机体内CAT与GSH-PX活性变化趋势较为相似,其原因可能与CAT、GSH-PX两者具有相同的非特异性免疫调控作用有关。此外,机体SOD、ACP、CAT及GSH-PX活性变化情况,与机体对外界污染物的胁迫响应、添加物类型、浓度及处理时间等密切相关,各抗氧化酶之间对清除机体氧化损伤也可能存在一定的协同作用。

3 结论

重金属Cd2+在双壳贝类机体内的生物蓄积,诱导机体内产生大量的自由基物质,从而造成机体内细胞膜与遗传物质的氧化损伤作用。因此,研究双壳贝类在重金属胁迫环境下的免疫功能变化及其调控方法,具有重要的实践意义。本文以正常紫贻贝和Cd2+胁迫紫贻贝为对照,分析比较亚硒酸钠、硒化卡拉胶及卡拉胶寡糖对紫贻贝机体内T-SOD、GSH-PX、ACP、CAT和PO活力的影响情况。结果发现,在15 d的暂养过程中,60和120 mg/L硒化卡拉胶及卡拉胶寡糖组,对紫贻贝体内以上多种抗氧化酶活力的恢复作用良好,其改善作用明显优于Cd2+胁迫紫贻贝自身恢复效果,有望作为一种新型双壳贝类免疫增强剂应用于贝类的净化暂养过程中。