不同发酵工艺糙米酵素中游离氨基酸、γ氨基丁酸及挥发性香气成分分析

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(1.河北农业大学食品科技学院,河北保定 071000; 2.衡水学院生命科学系,河北衡水 053000)

糙米(Brown rice)是指除了外壳之外都保留的全谷粒,其营养及保健价值均大于精白米[1],但由于其口感较粗,蒸煮耗时,不符合现代人饮食习惯,加工成精白米会造成人类食物资源浪费10%～20%[2]。糙米酵素是在糙米中加入蜂蜜、麦芽等,采用酵母等发酵而成的功能性食品基料。微生物通过本身的中间代谢,使底物产生一系列的生物化学变化,不仅改善了口感[3],而且在保留原有营养的基础上又通过微生物代谢产生了很多生理活性物质诸如γ-谷维醇[4-6]、γ-氨基丁酸(GABA)和谷胱甘肽(GSH)等[7]。其中游离氨基酸可起到影响食品风味的作用[8],而GABA是糙米及其发酵产品中含量丰富的抑制性神经递质[9],具有降血压、抗惊厥、改善脑机能和调节睡眠的作用[10]。

关于糙米酵素的研究，国外起步较早,日本和美国已有众多相关文献。而中国近年才有糙米酵素的研究报道,且较多集中于配方及工艺的探讨,对其营养价值诸如游离氨基酸和GABA,尤其对于不同发酵工艺下的探讨甚少[2],部分学者虽然对氨基酸或GABA相对含量作出了分析[11],但鉴于配方有别,或工艺未经糖化及巴氏杀菌,只集中探讨了单菌酵母发酵,并未对不同发酵工艺下游离氨基酸和GABA含量作综合探讨[12];且并未有学者对糙米酵素本身的挥发性香气成分作出过分析。

因此,本文集中探讨了在增加糖化及灭菌工艺,采用酿酒酵母与植物乳杆菌混菌发酵[13]后,分别以发酵液总体抗氧化(T-AOC)、还原糖消耗量、总超氧化物歧化酶(SOD)及GSH含量为指标得到的最优发酵工艺与优化前、传统酵母单菌发酵及未发酵原料作对比,采用氨基酸自动分析仪对以上7种样品的游离氨基酸及GABA的含量进行测定,并采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术,检测优化后、优化前及单菌发酵的挥发性香气成分,从而确定混菌发酵对营养价值水平及风味的影响,研究发酵工艺优化的结果,为更好地利用和开发糙米酵素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒酵母 安琪酵母股份有限公司;植物乳杆菌L42本实验室筛选及保藏[14];蜂蜜 桂林周氏顺发食品有限公司;糙米 黑龙江鹤岗市五谷农家养生坊;大麦芽、小麦芽 烟台市帝伯仕啤酒技术有限公司;γ-氨基丁酸 色谱纯(纯度:99.9%),上海源叶生物科技有限公司;5-磺基水杨酸 分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;3-辛醇 西格玛奥德里奇贸易有限公司;NaCl、(NH4)2SO4分析纯,天津市福晨化学试剂厂。

Z80目标准检验筛 浙江上虞市华丰五金仪器有限公司;LY20-A型水浴恒温振荡器 上海龙跃仪器设备有限公司;LD5-2A型低速离心机 北京京立离心机有限公司;SW-CJ-1FD型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;FA2204B型电子天平 上海天美天平仪器有限公司;101-1AB型电热恒温鼓风干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司;1-15PK型高速离心机 德国西格玛公司;L8900型全自动氨基酸分析仪 日本日立公司;DVB/CAR/PDMS型固相纤维萃取头 美国Supelco色谱科公司;7890B-5977A型Agilent气质联用仪(7890B型色谱仪配5977A型质谱检测器) 美国安捷伦科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程及操作要点

1.2.1.1 工艺流程 糙米发芽处理[15-16]→干燥→粉碎过筛→调配→糖化液化[17-19]→冷却→离心取上清→调配→巴氏杀菌[20]→冷却→不同工艺参数下接种发酵→巴氏杀菌→糙米酵素。

1.2.1.2 操作要点 糙米于37 ℃温水中浸泡1～2 d,每6 h换一次水,使芽体长度为1～2 mm;将发芽糙米沥干放入鼓风干燥箱中,50 ℃干燥4～5 h;冷却后使用食品粉碎机把烘干的糙米粉碎,并过80目筛备用;按照发酵培养基配方配制培养基:糙米粉10.710 g/100 mL、NaCl为0.240 g/100 mL、小麦芽0.250 g/100 mL、大麦芽0.500 g/100 mL、(NH4)2SO4为0.500 g/100 mL、茶叶粉0.025 g/100 mL[21];发酵培养基进行糖化液化,升温程序为:37 ℃保温10 min;52 ℃保温40 min;65 ℃保温1 h;78 ℃保温10 min[21];培养基冷却后离心(4360×g、15 min)取上清,添加蜂蜜3.38 g/100 mL进行调配,然后巴氏杀菌;灭菌后的培养基接入酿酒酵母、植物乳杆菌进行发酵。

1.2.2 不同发酵工艺发酵糙米酵素 以发酵液总抗氧化能力(T-AOC)为指标得到的最优发酵条件为发酵时间12 h,接种量7%(酿酒酵母与植物乳杆菌体积比为1∶1;酿酒酵母约为1.71×107CFU/mL,植物乳杆菌约为2.15×108CFU/mL),发酵温度34 ℃,摇床转速150 r/min;以还原糖消耗量为指标得到的最优发酵条件为发酵时间12 h,接种量7%,发酵温度37 ℃,摇床转速150 r/min;以总超氧化物歧化酶(SOD)为指标得到的最优发酵条件为发酵时间12 h,接种量7%,发酵温度37 ℃,摇床转速120 r/min;以还原型谷胱甘肽(GSH)含量为指标得到的最优发酵条件为发酵时间12 h,接种量7%,发酵温度34 ℃,摇床转速120 r/min。按顺序将T-AOC最优组、还原糖消耗最优组、SOD最优组、GSH最优组、未优化组(酿酒酵母发酵与植物乳杆菌体积比1∶1混菌发酵,接种量7%,发酵时间10 h,摇床转速150 r/min,温度34 ℃)、单菌发酵组(酿酒酵母发酵,接种量7%,发酵时间10 h,摇床转速150 r/min,温度34 ℃)和未发酵组编号1～7[21]。按照不同发酵工艺发酵,得到糙米酵素发酵液。

1.2.3 酵母酵素游离氨基酸及γ-氨基丁酸含量的测定

1.2.3.1γ-氨基丁酸待测液的制备 取适量糙米酵素液经过离心(2140×g,15 min)后取上清,转移至50 mL容量瓶加纯净水定容,取1 mL与8%质量分数的5-磺基水杨酸3 mL混合均匀,高速离心(12000 r/min,10 min),取上清液过0.22 μm滤膜后待测[22]。

1.2.3.2 游离氨基酸待测液的制备 取适量糙米酵素液加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液,放入105 ℃电热鼓风干燥箱水解24 h,取出冷却后转移至25 mL容量瓶,去离子水定容。过滤后取1 mL滤液置于60 ℃水浴脱酸,然后加1 mL去离子水蒸干得到干燥固体,然后将得到的干燥固体用0.02 mol/L稀盐酸洗至5 mL容量瓶,过0.22 μm滤膜后待测[22]。

1.2.3.3 氨基酸分析仪色谱条件 色谱柱:标准分析阳离子型交换树脂(4.6 mm×60 mm);进样量20 μL;输液泵压力0～20 MPa;柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液[12]流速0.45 mL/min;茚三酮反应液[12]流速0.35 mL/min;分离柱柱温57 ℃,反应柱柱温136 ℃;通道1:检测波长570 nm检测除脯氨酸外其他氨基酸;通道2:检测波长440 nm检测脯氨酸。

1.2.3.4 定性及定量 在上述氨基酸分析仪色谱条件下,17种氨基酸和γ-氨基丁酸达到明显的基线分离,并得出各种氨基酸的保留时间,按照峰面积归一化法计算出各氨基酸的相对含量。

1.2.4 糙米酵素挥发性香气成分的测定

1.2.4.1 挥发性香气成分的提取 采用纤维针式固相微萃取[23],取上述不同发酵工艺的糙米酵素液各7.5 mL,置于规格20 mL的顶空瓶中,分别加入1 g无水氯化钠和200 μL含量为0.25‰的内标物3-辛醇,在45 ℃恒温水浴下平衡10 min,插入活化萃取针进行顶空固相微萃取,萃取时间40 min[24]。

1.2.4.2 GC条件 色谱柱:HP-INNO Wax(60 m×250 μm×0.25 μm);固相微萃取纤维针:50/30 μm;进样口温度:250 ℃;检测器温度:230 ℃;载气:氦气;流量1 mL/min;升温程序:50 ℃保持2 min,然后以3 ℃/min升温至80 ℃,再以5 ℃/min升温至230 ℃,保持6 min[25]。

1.2.4.3 MS条件 电离源:EI;电子能量:70 eV;扫描范围:35.0～500.0 amu。

1.2.5 定性及定量 在上述GC-MS条件下,通过气质联用检测技术对3种不同发酵条件下的糙米酵素香气成分进行检测分析,取谱库(NIST14)中匹配度大于80%的物质进行定性分析;以1.2.4.1固相微萃取的内标物含量为参考,按照峰面积归一化法对香气成分进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸的含量与分析

游离氨基酸混标图谱如图1所示,图2为第3组游离氨基酸的测定图谱,1～7组游离氨基酸的测定结果见表1所示。

表1 1～7组发酵液中游离氨基酸的含量(mg/mL)Table 1 Free amino acid contents in fermentation broth of group 1～7(mg/mL)

图1 游离氨基酸的标准图谱Fig.1 Standard map of free amino acids

图2 组3的游离氨基酸的测定图谱Fig.2 Determination of free amino acids in group 3

游离氨基酸本身可呈现出酸、甜、苦和鲜等味道[26]。其中谷氨酸和天门冬氨酸起到鲜味作用[27],由表1可知,4号组两种氨基酸总含量最高可达2.785 mg/mL,相比较5号未优化组的2.547 mg/mL和7号未发酵组的2.311 mg/mL分别提升0.238、0.474 mg/mL,相较于6号单菌发酵组,鲜味类氨基酸提升不明显;呈苦味氨基酸基本包括苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸[13],1号组四种氨基酸总含量最高达0.920 mg/mL,相比较5、6、7号组的0.839、0.868、0.822 mg/mL,变化较不明显;起甜味作用的氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸和赖氨酸[28],1号组六种氨基酸总含量可达2.744 mg/mL,相较5、6、7号组的2.671、2.273、1.914 mg/mL分别提高0.073、0.471、0.830 mg/mL。随着发酵过程中葡萄糖、果糖和麦芽糖的消耗,呈甜味氨基酸含量增高弥补了甜味的流失,表现在感官上则是产品的酸甜适口,其中赖氨酸作为必需氨基酸谷物类食品中含量较少,未发酵7号组含量为0.121 mg/mL,经发酵后最高可达1号组的0.184 mg/mL,提高约52.07%。

以发酵优化较好的1号组为例,其含量较高的呈味氨基酸分别为谷氨酸、丙氨酸、天门冬氨、脯氨酸和甘氨酸,五种氨基酸总含量可占到总氨基酸含量的68.10%,共同赋予了酵素产品酸甜鲜的滋味,可认为以上五种氨基酸为糙米酵素的特征性风味物质;综合对比分析1～7组,EAA/TAA比值在13.3%～17.9%范围内,EAA/NEAA比值在19.5%～21.8%范围内,发酵前后并无明显变化;氨基酸总量最高可达4号组的7.151 mg/mL,相较5号未优化组、6号单菌发酵组和7号未发酵组分别提高0.36、0.464、1.496 mg/mL,充分表明混菌发酵相比较单菌发酵优势明显。

2.2 GABA的含量与分析

图3为GABA混标图谱,图4为第3组GABA的测定图谱,1～7组GABA的测定结果见表2。由表2可知,GABA含量经过工艺优化后显著提高(P<0.05)。以最高的1号组为例,优化后GABA含量最高可达2.595 mg/mL,相比较5号未优化组、6号单菌发酵组和7号未发酵组的2.322、1.977和1.324 mg/mL分别提高约11.76%、31.26%和96.00%,对比其他自制液态糙米酵素,工艺优化后GABA相对含量更高[29],同时GABA含量的提升同样表明混菌发酵相比较单菌发酵优势明显。

表2 1～7组发酵液中GABA的含量(mg/mL)Table 2 GABA contents in fermentation broth of group 1～7(mg/mL)

图3 GABA的混标图谱Fig.3 GABA’s mixed spectrum

图4 组3的GABA的测定图谱Fig.4 Determination spectrum of GABA in group 4

2.3 挥发性香气成分分析

表3为选取匹配度80以上的分析鉴定结果,包含香气成分的参考阈值[30]及风味描述[31-32]。但由于呈香化合物风味描述与主观评定相关,阈值与蒸气压相关,而蒸气压受温度及溶剂介质的影响[32]。并且糙米酵素并无相关研究分析其香气成分。本试验样品中水和乙醇作为溶剂所占比例最大,一般含酒精的体系内,化合物阈值随乙醇浓度的升高而增大[33],而本试验中糙米酵素的酒精度经测定约为2%vol～3%vol,故本文参考各香气成分在啤酒中的阈值,如无文献可考则参考水中的香气阈值,温度均为20 ℃。一些化合物阈值有争议的,如香气与香味、鼻前鼻后感觉的定义在各学者之间有不同观点的[31],已在表中括号注明阈值测定方法。

如表3所示,单菌发酵的挥发性香气成分为11种,混菌发酵分别产生挥发性香气成分22种,共产生了异丁醇、异戊醇、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-辛醇、2,3-丁二醇、1-壬醇7种醇类物质;己酸和辛酸2种酸类物质;乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、苯乙酸乙酯和乙酸苯乙酯7种酯类物质;3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)1种酮类;2-甲基吡嗪一种吡嗪类和4-乙烯基愈创木酚1种酚类。混菌发酵优化后减少了八甲基环四硅氧烷、正己醇和糖醛3种物质的含量。

糙米酵素经过不同工艺混菌发酵后相比于单菌发酵分别增加了11种挥发性香气成分。根据气味活度值(OAV)[34]或芳香值[32]的定义描述,OAV=食品中香味化合物的浓度/食品中香味化合物的阈值,在多数情况下当某一成分OAV<1时说明该组分对食品香气不起直接作用,大于1时嗅觉可辨,此值越大,说明其越是该体系的特征嗅感化合物。如表3中所示,混菌发酵后糙米酵素中OAV值经过密度换算明显大于1的有乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、1-辛烯-3-醇和4-乙烯基愈创木酚,其中四种酯类不受工艺变化影响全部检出,表现在风味描述上为水果香、甜香及花香,与实际观感较为一致,因此以上四种酯类为酵母及乳酸混合发酵糙米酵素的重要特征性风味物质,同时也证明混菌发酵相比于单菌发酵不仅在营养物质含量方面占有一定优势,也在改善产品风味方面有重要作用。

表3 不同发酵工艺糙米酵素主要香气成分Table 3 Volatile aroma components of different fermentation brown rice enzyme

3 结论

工艺优化后的1～4组总游离氨基酸、必需氨基酸及呈味氨基酸含量均显著高于工艺优化前、单菌发酵及未发酵的5～7组(P<0.05),1～3组GABA含量相对于5～7组也有较大提高(P<0.05),说明分别以发酵液T-AOC、还原糖消耗量、SOD及GSH含量为指标对发酵工艺所作优化结果良好,其中1号组优化情况最佳,呈味氨基酸、必需氨基酸及GABA含量最高,证明混菌发酵相比于单菌发酵可行而且结果更佳。在挥发性香气成分种类及含量上,混菌发酵同样优于传统的酵母单菌发酵,不仅增加了11种香气成分,而且增加了乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯四种特征风味物质,同时发酵工艺的不同导致混菌发酵产生的挥发性香气成分含量及种类有所不同,混菌发酵在改善糙米酵素风味方面还有待更进一步研究。

糙米原料发酵前后的EAA/TAA比值与EAA/NEAA比值均无明显变化,且分别低于FAO/WHO推荐的理想蛋白模式下的40%与60%标准[29]。除了原料本身经过糖化沉淀处理,只保留了可溶性蛋白可游离氨基酸以外,在发酵调控上还有改进空间。挥发性香气成分的研究尚属初级,需要更进一步探讨香气成分产生的机理,期待后续学者更进一步完善糙米酵素发酵的关键工艺。