响应面法优化复合酶辅助超声波提取柚子皮总黄酮工艺

刘媛洁1,张 良

(1.江西医学高等专科学校,江西上饶 334000; 2.江西省食品发酵研究所,江西宜春 336000)

柚子(Citrusgrandis)为芸香科柑橘属的植物果实[1],主要产区是南方地域[2-3]。柚子属于药食两用水果,性寒,味清香、酸爽,含有黄酮、多酚、果胶、膳食纤维、多糖、有机酸、维生素和微量矿物元素等多种有益成分[4-6],其中,柚子皮中含有以柚皮苷和橙皮苷为主要物质的黄酮类化合物[7-9],具有理气消痰、健胃消食、预防动脉硬化、降血脂、抗氧化等功效[10-12]。我国柚子产量高,资源丰富[13],而柚子皮的重量占整个果实的30%～50%[14-15],可见,对柚子皮的综合利用与开发是十分必要的。

目前,柚子皮中总黄酮的提取方法多采用溶剂浸提取法、碱提酸沉法、超声波提取法、微波提取法等[16],例如:何颖[17]采用50%乙醇溶液提取总黄酮得率为0.625%;郑培君等[18]采用80%乙醇溶液结合三因素三水平的响应面分析方法提取总黄酮的得率为0.864%;李敏等[19]采用乙醇浸提超声波辅助提取总黄酮的得率为0.6225%。超声波提取法是利用其产生的空化作用有效地破坏组织的细胞壁,使胞内的活性成分更好地流出到溶剂中,从而达到提高提取率的效果[20]。酶解提取法是利用具有专一性和高效性的酶来分解破坏植物细胞壁和细胞间质等组织结构,使细胞内活性成分更易溶出与扩散,从而提高提取效率[21]。酶法超声波辅助提取法能有效结合酶解提取法和超声提取法的优点,能协同有效地提高提取效率,用时短,应用性强[22],但以酶法结合超声波辅助提取柚子皮中总黄酮的方法尚未见报道。

本研究以酶法超声波辅助提取柚子皮中总黄酮,在单因素实验的基础,运用Plackett-Burnman试验设计与数据分析筛选出显著性影响要素因子,进一步采用Box-Behnken试验设计优化了柚子皮中的总黄酮提取条件,可为后续研究提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柚子 产自江西广丰的马家柚;纤维素酶(2万U/g)、果胶酶(3万U/g) 北京索莱宝科技有限公司;芦丁标准品(HPLC≥98%) 合肥博美生物科技有限责任公司;Al(NO3)3、NaOH、NaNO2、乙醇 均为分析纯,北京索莱宝科技有限公司;去离子水 实验室自制;其他试剂 均为分析纯。

XA-1型固体样品粉碎机 常州市金坛区环宇科学仪器厂;HWS-24型恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;DSA300-XN2型超声波仪 福州德森精工有限公司;FA6103C型电子天平 上海精科天美有限公司;3K15型冷冻离心机 Sigma;DZF6020型电热鼓风干燥箱 无锡莱蒲仪器设备有限公司;PHSJ-4F型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;TU-1900型分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柚子皮的预处理 将新鲜广丰马家柚剥下的皮切成5 cm2碎块,在60 ℃下干燥24 h,粉碎后过60目筛,将制备好的柚子粉末放入干燥器中密封备用。

1.2.2 柚子皮中总黄酮提取工艺 称取5 g处理好的柚子皮粉末置于500 mL锥形瓶中,以一定的料液比添加浓度为80%的乙醇溶液浸泡12 h,根据柚子皮的质量比例加入一定量的复合酶(纤维素酶和果胶酶),在一定的pH和温度下进行水浴酶解(30 min混匀一次)后,100 ℃水浴灭酶活5 min。然后,再加入100 mL浓度为80%的乙醇溶液,在一定的超声功率、超声温度和超声时间下对上述酶解液进行超声处理,最后对超声处理的样品溶液离心后取上清液。

1.2.3 单因素实验 以复合酶的配比、复合酶的用量、pH、料液比、酶解温度、酶解时间、超声功率、超声时间为要素因子,研究各要素因子对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.3.1 复合酶的配比 按照“1.2.2”的方法,固定料液比为1∶20,复合酶的用量为1.0%，pH4.0,酶解温度为50 ℃,酶解时间为90 min,超声功率为220 W,超声时间为60 min,考察纤维素酶与果胶酶的配比(1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1 g/g)对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.3.2 复合酶的用量 在上述优化复合酶的配比的基础上,固定料液比为1∶20,pH4.0,酶解温度为50 ℃,酶解时间为90 min,超声功率220 W,超声时间为60 min,考察复合酶的用量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.3.3 pH 在上述优化的复合酶的配比和复合酶的用量的基础上,固定料液比为1∶20,酶解温度50 ℃,酶解时间为90 min,超声功率220 W,超声时间为60 min,考察pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.3.4 料液比 在上述优化的复合酶的配比、复合酶的用量和pH的基础上,固定酶解温度为50 ℃,酶解时间为90 min,超声功率220 W,超声时间为60 min,考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.3.5 酶解温度 在上述优化的复合酶的配比、复合酶的用量、pH和料液比的基础上,固定酶解时间为90 min,超声功率为220 W,超声时间为60 min,考察酶解温度(30、40、50、60、70 ℃)对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.3.6 酶解时间 在上述优化的复合酶的配比、复合酶的用量、pH、料液比和酶解温度的基础上,固定超声功率为220 W,超声时间为60 min,考察酶解时间(30、45、60、75、90 min)对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.3.7 超声功率 在上述优化的复合酶的配比、复合酶的用量、pH、料液比、酶解温度和酶解时间的基础上,固定超声时间为60 min,考察超声功率(100、140、180、220、260 W)对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.3.8 超声时间 在上述优化的复合酶的配比、复合酶的用量、pH、料液比、酶解温度、酶解时间和超声功率的基础上,考察超声时间(10、20、30、40、50、60 min)对柚子皮中总黄酮得率的影响。

1.2.4 Plackett-Burman试验设计 当实验中要素因子较多时,可选用Plackett-Burman试验设计,可通过分析比较各因素效应值及其显著性,筛选出有显著影响的因素[23-24]。以柚子皮中的总黄酮得率为响应值,单因素实验为基础,选取复合酶的配比(纤维素酶∶果胶酶)、复合酶的用量、pH、料液比、酶解温度、酶解时间、超声功率、超声时间共8个因素的水平值,选用Plackett-Burman试验设计来确定显著性影响因素,为进一步的Box-Behnken试验奠定基础。试验设计因素及水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.5 响应面试验 在Plackett-Burman试验基础上,以复合酶的用量、酶解温度、超声功率和超声时间为自变量,以柚子皮中总黄酮得率为响应值,设计响应面试验,确定最佳实验条件。Box-Behnken试验设计见表2。

表2 Box-Behnken试验因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.6 总黄酮得率的测定

1.2.6.1 吸收波长的选择 分别取芦丁标准品溶液和柚子皮提取液,以乙醇溶液为空白对照,紫外分光光度计在200～600 nm波长范围内进行扫描,结果表明,芦丁标准品和柚子皮提取液在510 nm波长下均有最大吸收,由此确定510 nm为检测波长。

1.2.6.2 芦丁标准曲线的的绘制 参考赵国超、郑丽等的方法[25-26],稍加修改。精确称取20 mg芦丁标准样品放于10 mL容量瓶中,浓度为80%的乙醇定容后摇匀,获得质量浓度为2.0 mg/mL 的芦丁标准溶液。六支10 mL具塞管中分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL芦丁标准溶液,各管中再分别加入80%的乙醇3.0 mL和5% 的NaNO2溶液0.5 mL,摇匀后静置10 min;然后各管中分别加入14% Al(NO3)3溶液0.5 mL,摇匀后静置10 min;各管中再加入4% NaOH溶液3.0 mL;最后用80%乙醇定容至10.0 mL,摇匀后静置8 min。510 nm波长下测吸光度值,同时做空白对照,经计算线性回归方程为:y=0.8058x+0.0224,R2=0.9992,其中y为吸光度,x为芦丁质量浓度(mg/mL),根据试验结果,芦丁在0.1～0.6 mg/mL浓度范围内与吸光度有良好的线性关系。

1.2.6.3 总黄酮得率的计算 将1.2.2获得的上清液液定容到200 mL,取1 mL置于10 mL具塞管中,按“1.2.6.2”方法测得吸光度值,将其代入“1.2.6.2”回归方程中计算柚子皮总黄酮提取液的质量浓度。总黄酮得率的计算公式如下:

式中:C为柚子皮总黄酮提取液的质量浓度(mg/mL);V为样品定容体积(mL);N为测定时样液的稀释倍数;M为浸提用的柚子皮粉末的质量(g)。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次,结果取平均值并计算标准误差,运用Excel软件绘制趋势曲线图。采用JMP Trial 14软件进行Plackett-Burman试验设计及数据处理,用Design-Expert 7.0软件进行Box-Behnken试验设计及数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 复合酶的配比对柚子皮中总黄酮得率的影响 由图1可知,柚子皮中总黄酮得率随着纤维素酶添加比例的增加,呈现先增加后减少的趋势,当纤维素酶和果胶酶的配比为3∶2时,总黄酮得率达最大值为0.86%,纤维素酶添加比例继续增加时,总黄酮得率呈下降趋势。可能是随着纤维素酶的比例增加,能更好地破坏柚子皮的细胞壁及细胞间质,使得细胞中的总黄酮等活性成分更好地溶出,但随着纤维素酶比例的增加,底物浓度不能对复合酶达到饱和,复合酶的作用受到抑制,导致柚子皮总黄酮得率并没有增加。所以,选择纤维素酶和果胶酶的配比为3∶2。

图1 复合酶的配比对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of complex enzyme ratio on the yield of total flavonoids

2.1.2 复合酶的用量对柚子皮中总黄酮得率的影响 由图2可知,柚子皮中总黄酮得率随着复合酶的用量的增加呈现先增加后减少的趋势,当复合酶的用量达到1.5%时,总黄酮得率为最大值为1.02%。当复合酶的用量大于1.5%时,总黄酮得率呈现下降趋势。可能是随着复合酶用量的增加能更好地破坏细胞壁,有助于总黄酮的溶出,总黄酮得率逐渐增加;当复合酶的用量超过1.5%后,随着复合酶的用量的增加,底物浓度不能使酶达到饱和,导致了酶的作用受到抑制,总黄酮得率不再增加[27]。所以,选择复合酶的用量为1.5%。

图2 复合酶的用量对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of complex enzyme dosage on the yield of total flavonoids

2.1.3 pH对柚子皮中总黄酮得率的影响 实验用纤维素酶的最适pH在4.0～6.5,果胶酶的最适pH在3.0～6.0之间。由图3可知,在pH在3.0～5.0时,柚子皮中总黄酮得率随着pH的增大,呈现先增加后减少的趋势。当pH为4.5时,柚子皮中总黄酮得率达最大值为1.29%。pH为4.5时,纤维素酶和果胶酶的复合酶活力为最佳值,使得细胞壁及细胞间质破坏率高,总黄酮等活性成分能更好地溶出,总黄酮得率相对较大[28]。所以,选择酶解时的pH为4.5。

图3 pH对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of pH on the yield of total flavonoids

2.1.4 料液比对柚子皮中总黄酮得率的影响 由图4可知,随着料液比的增大,柚子皮中总黄酮得率呈现先增加而后平缓略有下降的趋势。当料液比为1∶20 g/mL时,柚子皮中总黄酮得率达最大值为1.24%。可能是随着料液比的增大,一方面溶剂量逐渐增加,总黄酮溶出逐渐增加,另一方面酶与底物反应更充分,酶解效果较好,总黄酮得率逐渐增加;当料液比超过1∶20 g/mL后,继续增加料液比,相对于稀释了酶与底物的浓度,酶解的效果变差,导致总黄酮得率略有下降[29]。所以,选择料液比为1∶20 g/mL。

图4 料液比对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on the yield of total flavonoids

2.1.5 酶解温度对柚子皮中总黄酮得率的影响 由图5可知,随酶解温度的升高,柚子皮中总黄酮得率呈现先增加后明显减少的趋势。当酶解温度为50 ℃时,总黄酮得率达最大值为1.25%。可能是随着温度的增加,复合酶的活性逐渐升高,酶与底物反应速率逐渐增加,总黄酮得率逐渐增加;当酶解温度超过50 ℃后,纤维素酶和果胶酶的复合酶活力有所降低,酶解效率降低,导致总黄酮得率有明显减少的趋势。所以,选择酶解温度为50 ℃。

图5 酶解温度对总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of total flavonoids

2.1.6 酶解时间对柚子皮中总黄酮得率的影响 由图6可知,柚子皮中总黄酮得率随着酶解时间的延长,呈现先增加后缓慢减少的趋势。当酶解时间为60 min时,总黄酮得率达最大值为1.46%。分析原因,可能是随着酶解时间的增加,酶活力得到充分的利用,酶解反应更完全,总黄酮溶出增加,总黄酮得率逐渐增加;当酶解时间超过60 min后继续酶解,不但不会提高提取效率,可能还会导致黄酮类物质遭到破坏[30]。所以,选择酶解时间为60 min。

图6 酶解时间对总黄酮得率的影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of total flavonoids

2.1.7 超声功率对柚子皮中总黄酮得率的影响 由图7可知,柚子皮中总黄酮得率随着超声功率的增大,呈现先增加而后减少的趋势。当超声功率为180 W时,柚子皮中总黄酮得率达最大值为1.62%。可能是随着超声功率逐渐增加,物料底物能充分地受到超声波的作用,总黄酮得率逐渐增加;当超声功率超过180 W后,继续增大超声功率,会显著破坏总黄酮的结构,导致总黄酮得率的减少[31]。所以,选择超声功率为180 W。

图7 超声功率对总黄酮得率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids

2.1.8 超声时间对柚子皮中总黄酮得率的影响 由图8可知,柚子皮中总黄酮得率随着超声时间的延长,呈现先增加后减少的趋势。当超声时间为40 min时,柚子皮中总黄酮得率达最大值为2.07%。可能是随着超声时间的增加,能更好地破坏细胞壁,使得细胞内容物总黄酮溶出增加,总黄酮得率逐渐增加;当超声时间达到一定值后继续增加,超声会破坏总黄酮等物质的结构,选用JMP软件对表3中的实验数据进行回归分析和显著性检验,结果见表4和表5。由表4可知,该模型(P<0.01)极显著。由表5可知,因素X2(复合酶的用量)、X5(酶解温度)、X8(超声时间)对柚子皮中总黄酮得率影响极显著(P<0.01);因素X7(超声功率)对柚子皮中总黄酮得率影响显著(P<0.05),所以选择X2、X5、X8、X7共4个因素进行响应面优化试验。因素X3(pH)、X4(料液比)、X1(复合酶的配比)和X6(酶解时间)对柚子皮中总黄酮得率影响不显著,所以在后续优化试验中X3、X4、X1和X6共4个因素的条件固定为:pH4.5、料液比1∶20 g/mL、复合酶的配比3∶2、酶解时间60 min。

表3 Plackett-Burman设计的各因素水平及响应值Table 3 Levels of various factors and response results of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman设计的方差分析表Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman design

表5 偏回归系数及显著性检验Table 5 Partial regression coefficients and their significance test

图8 超声时间对总黄酮得率的影响Fig.8 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids

2.2 Plackett-Burman试验结果

Plackett-Burman试验设计及响应值见表3,方差分析结果见表4,偏回归系数及显著性检验见表5。

2.3 响应面试验结果

响应面试验设计及结果见表6。表6中的实验数据经Design-Expert 7.0软件处理,得到回归模型的方差分析,结果见表7。经非线性回归的二次多项式拟合,得到预测模型如下:

表6 响应面试验设计及结果Table 6 Design and results for response surface experiment

Y=-10.3584+2.6902A+0.2420B+0.0182C+0.0931D-1.0003A2-0.0025B2-0.0001C2-0.0013D2+0.0095AB+0.0031AC-0.0080A D-0.00002BC+0.0004BD+0.00005CD

表7 回归模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

响应面可以反映因素之间的影响程度,其中影响越大,曲面越陡峭[33]。图9反映了四个因素的交互作用对柚子皮中总黄酮得率的影响。可见,复合酶的用量与超声功率的交互作用对柚子皮中总黄酮得率的影响显著(P<0.05);复合酶的用量与酶解温度、复合酶的用量与超声时间、酶解温度与超声功率、酶解温度与超声时间和超声功率与超声时间的交互作用对柚子皮中总黄酮得率的影响不显著(P>0.05)。根据对柚子皮中总黄酮得率的二次多项回归方程求解,得到最佳提取工艺条件为:复合酶的用量1.73%、酶解温度54.98 ℃、超声功率183.43 W,超声时间41.37 min,在此最佳条件下,总黄酮得率理论上可达2.22%。

图9 交互项对总黄酮得率影响的响应面Fig.9 Response surface showing the effect of interaction terms on the yield of total flavonoids

考虑实验可操作性,修正最佳的提取工艺条件为:复合酶的用量1.70%、酶解温度55.0 ℃、超声功率183.00 W,超声时间41.00 min,在此条件下,3次平行试验后,实测总黄酮得率的平均值为 2.19%,与模型预测值的相对误差为 1.4%,表明该模型拟合程度较好,验证了该模型的可靠性。

3 结论

本研究首次采用酶法结合超声波辅助提取方法,应用于柚子皮中总黄酮的提取工艺中。首先,基于单因素实验结果,运用Plackett-Burman试验筛选出了具有显著影响的因素,再进一步用Box-Behnken试验设计优化了具有显著性影响的因素,最终确定最佳的提取工艺条件为:复合酶的配比(纤维素酶∶果胶酶)为3∶2、复合酶的用量1.70%、pH4.5、料液比1∶20 g/mL、酶解温度55.0 ℃、酶解时间60 min、超声功率183.00 W、超声时间41.00 min。在此条件下,进行3次平行试验后实测柚子皮中总黄酮得率的平均值为2.19%。本实验得到的总黄酮得率与何颖[24]、郑培君等[11]和李敏等[29]相比分别提高了2.5倍、1.53倍和2.51倍,本方法提取效率相对较高。可见,酶法-超声波辅助提取方法应用于柚子皮中总黄酮的提取中效果较好,工艺简单,复制性强,可为进一步的实验研究奠定基础。