移动式填充床固态发酵反应器的设计及单宁酶中试发酵

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(1.集美大学食品与工程学院,福建厦门 361021; 2.福建省食品微生物与酶工程实验室,福建厦门 361021)

固态发酵(Solid-state fermentation,SSF)是一种原始的传统发酵方式,在我国已有数千年的历史,在食品工业中的应用主要有食用菌、酶制剂、红曲的生产以及酱油的酿造等[1]。固体发酵由于条件不易控制,难以实现纯种发酵,因此在很长一段时间内被忽视。然而,固体发酵更加有利于微生物生长,发酵产物活性高、培养基成分来源广且价格低廉、耗能低、无污染[2]。近年来,新型固态发酵反应器的研制[3]以及数学模型的建立[4],推进了固态发酵的发展。

填充床式反应器是固态发酵设备之一,以静态发酵为基础,将培养基置于打孔的支撑板上,通过强制通风为微生物供氧,同时调节基质的温度和湿度[5]。然而,由于空气通过料层时带走热量,在空气进口和出口之间形成温度差,使空气的持水性增加,引起基质中水分的散失[6],影响微生物的生长和代谢,故固态发酵设备的设计和应用,需要评估固态发酵过程中温度、湿度与微生物生长之间的关系。

单宁酶在食品、饮料、化工制药、化妆品、饲料及污水处理等行业中均有广泛的应用,具有潜在的商业价值[7-9]。目前,对单宁酶还主要局限于基础研究,已有的发酵工艺成本居高不下,酶活性不高,阻碍了单宁酶产业化进程，因此,研究单宁酶大规模的固态发酵生产具有重要的意义。本研究结合传统厚层通风制曲设备的结构,对移动式填充床固态发酵反应器的整体布局和结构进行设计,选购相应标准的附件,组装成风速可控、料层厚度可调节的中试型填充床固态发酵设备并对单宁酶固态发酵进行了中试，以期为后续固态发酵反应器的设计改造和大规模的单宁酶发酵生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种(AspergillusnigerJMU-TS528) 集美大学食品与生物工程实验室保藏;茶梗 福建省泉州市安溪茶园;浓硫酸、NaOH、无水乙醇、乙酰丙酮、对二氨基苯甲醛 西陇化工股份有限公司;绕丹宁 东京化成工业株式会社;没食子酸、没食子酸丙酯 国药集团。

MJX智能型霉菌培养箱 宁波莱福科技有限公司,SW-CJ-2F双人双面洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;WK-1600A高速药物粉碎机 山东省青州市精诚机械优先公司;20目国家标准检验筛 浙江上虞市金鼎标准筛具厂;FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;WNB-10数显恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;Unic7200可见分光光度计 尤尼柯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 移动式填充床固态发酵反应器的结构设计 试验的固态发酵过程与制曲的过程相类似,均以霉菌为出发菌株,以固体物质为基质,在一定的温度和湿度条件下进行发酵。首先,物料接种后搅拌均匀,平铺在箱体内的料槽之上,加盖密封。发酵初期为孢子萌发期,此阶段培养箱内原有的空气足够供应微生物生长,可采取静置培养的方式,微生物依靠自身呼吸作用和代谢产生的热量会使培养基温度上升,达到最适生长温度;随后,菌丝生长逐渐旺盛,温度继续升高,此时,由于料层厚度不同造成的温度梯度的现象开始出现;采取间歇通风的方式,使新鲜空气通过料槽底部的密孔,穿过物料层,经鼓风机带动气体循环,从而保证曲料中温度的稳定,同时供给生长中所需的氧气。目前,无论是酱油制曲还是酶的发酵,所使用的设备多为固定式设备,移动和清洗困难。基于以上分析,设计的移动式固态发酵反应器应满足:发酵物温度、湿度、供氧均匀,能及时控制发酵物温度、湿度;发酵量可以根据需要调整,反应器结构简单;清洗容易,无死角。

1.2.2 培养基的配制 PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,自来水1000 mL,自然pH。

固态发酵培养基(DM%,W/W):茶梗87.7%、NH4Cl 5%、蔗糖7%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.1%、NaCl 0.1%;配制时使用自来水溶解无机盐,喷洒茶梗基质至含水量在65%～80%。

种子培养基:三角瓶种子装量为5 g干物质的固态发酵培养基,接种前经1.01 MPa、121 ℃灭菌20 min。

1.2.3 原料处理 茶梗在105 ℃恒温干燥箱干燥2 h后粉碎,过20目筛备用。

1.2.4 单孢子菌悬液的制备 用新制备的PDA斜面培养基活化保存在4 ℃冰箱内的黑曲霉菌株,30 ℃培养96 h至有大量成熟孢子产生。用预先灭菌的0.01%(V/V)吐温-80溶液冲洗孢子,冲洗下的孢子液装入有无菌玻璃珠的三角瓶中,摇床振荡30 min打散孢子,将孢子悬液的OD600的值调至2.0,得到浓度约为1.0×108个/mL的黑曲霉孢子悬液。

1.2.5 种子的制备 种子培养基配制完成后,每瓶接入4 mL单孢子菌悬液(1×108个/mL)混匀,置于28 ℃恒温培养箱中静置培养72 h。

1.2.6 单宁酶固态发酵中试 配制5 kg/批次干物质的中试固态发酵培养基,接入1%(w/w)种子培养基,加入10 L配制的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液,搅拌均匀,以抛洒的方式填入填充床固态发酵培养箱中,料层厚度约为10 cm。发酵过程控制进风与回风比为0∶1,发酵前24 h静置培养,24 h以后,开启鼓风机,调节入风口阀门大小,改变通风量,并对单宁酶进行固态发酵。

1.2.7 喷洒增湿 前期对黑曲霉固态发酵产单宁酶条件优化时,发现物料水分在60%～80%有利于单宁酶的产生[10]。因此,本试验控制整个发酵过程的湿度在60%～80%,当湿度低于60%时,利用喷洒装置以0.1 m/min的速度对物料进行增湿,待物料含水率接近80%时,停止增湿。

1.2.8 通风量(10、20、30 m3/h)对单宁酶中试发酵的影响

12.8.1 10 m3/h通风量对单宁酶发酵的影响 调节入风口阀门大小,使进入培养箱内的空气流量为10 m3/h,测定在此通风量条件下发酵过程中不同时间的酶活、生物量、温度、含水量。

12.8.2 15 m3/h通风量对单宁酶发酵的影响 调节入风口阀门大小,将通风量提高至15 m3/h,测定在此通风量条件下发酵过程中不同时间、位置的酶活、生物量、温度、含水量。

12.8.3 20 m3/h通风量对单宁酶发酵的影响 调节入风口阀门大小,将通风量提高至20 m3/h,测定在此通风量条件下发酵过程中不同时间、位置的酶活、生物量、温度、含水量。

1.2.9 粗酶液的提取 以每5 g培养基干物质加入50 mL 0.02 mol/L磷酸盐缓冲液的比例添加缓冲液,搅拌后置于25 ℃、180 r/min的摇床上振荡0.5 h,定性滤纸过滤,收集到的酶液即粗酶液。

1.2.10 指标测定

1.2.10.1 单宁酶活力的测定 参考保玉心等[11]测定单宁酶活力的方法:取3支10 mL的离心管,分别0.25 mL没食子酸丙酯溶液(0.01 mol/L),将0.25 mL柠檬酸缓冲液加入空白管中,0.25 mL粗酶液加入到测试管中,3支离心管放于30 ℃温育5 min后加入0.3 mL甲醇绕丹宁溶液(0.05 mol/L),30 ℃温育5 min,后在对照管中加入0.25 mL灭活的粗酶液,然后3支离心管中分别加入0.2 mL的KOH溶液(0.5 mol/L),30 ℃温育5 min,最后每支试管都用4 mL蒸馏水稀释,30 ℃温育5 min,在520 nm处,测定反应混合物的吸光值。单宁酶的酶活由吸光值的变化来计算。

酶活定义:30 ℃条件下每分钟产生1 μmol没食子酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

1.2.10.2 生物量测定 准确称取5 g培养基干物质,在80 ℃烘干至恒重称质量,统计单位物料的生物量,即mg/g ds(mg/克干物质)。

1.2.10.3 水分含量测定 称取一定质量的培养基干物质在80 ℃烘干至恒重称重,计算减少的质量并用百分比表示水分含量。

1.3 数据处理

Microsoft Excel 2010软件统计分析平均值和标准差,SPSS-IBM 19.0软件进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 固体发酵工艺与固态发酵反应器的结构设计

微生物的固态发酵需要保证营养物质、温度、水分和氧气。在通风固体发酵制曲的过程中,风依靠风机从曲料底部进入,依靠通风带走曲料生长过程中产生的热量,从而保证曲料中温度的稳定,同时供给生长中所需的氧气。其示意图如图1所示。

图1 通风发酵制曲示意图Fig.1 Schematic diagram of ventilate koji-making注:1:物料箱;2:料槽;3:风道;4:供风系统;5:假底;6:池底。

结合通风发酵曲池的理念,设计适用于实验室中试规模的单宁酶的固态发酵的培养箱。发酵规模为5 kg/批次(干物质),培养时间为96～168 h。发酵期间基质内部最高温度大于40 ℃,且培养基质内会出现明显的温度梯度。在控温的同时应考虑培养基质及培养箱内环境的湿度变化。因此,移动式固态发酵反应器由曲床、温湿度控制系统、通风系统、风量调节系统、壳体、移动系统几部分组成,其设备结构如图2所示:

图2 移动式发酵培养箱结构图Fig.2 Structure of removable fermentation incubator注:1:通水管;2:喷雾口;3:物料箱;4:侧门;5:料槽;6:滑道;7:均风板;8:假底;9:支架;10:万向轮;11:排水管;12:入风口;13:鼓风机;14:空气入口;15:转子流量计;16:出风口。

为了对发酵过程中物料的温度及培养箱内的湿度进行监控,需安装相应的温湿度记录仪。将高100 mm、长1200 mm的发酵物料分为靠近通风口处(A)、培养箱中部(B)和远离通风口(C)的位置3处,上层(30 mm),中层(35 mm)和下层(35 mm)3层,设置9个测温点,每层3个,分别命名为TA-1、TA-2、TA-3、TB-1、…TC-3。如图3所示:

图3 填充床反应器各测温点位置Fig.3 Temperature measuring point location in packed bed bioreactor

根据对移动式填充床固态发酵反应器的基础结构设计、风机及温湿度记录仪的选择,委托仪器制造厂家制作相应的移动式固态发酵反应器,样机如图4所示。

图4 移动式填充床固态发酵反应器样机Fig.4 Mobile able packed-up solid-state incubator注:a:外观结构;b:内部形态及通风系统。

2.2 单宁酶固态发酵中试

利用实验室自行设计的填充床式发酵培养箱进行单宁酶固态发酵,并探究不同通风量对单宁酶发酵效果的影响。

2.2.1 10 m3/h通风量条件下的试验结果 前期预实验发现,10 m3/h通风量对发酵物料不同部位的酶活、含水量、生物量等影响微小,故后期发酵时未对10 m3/h通风量的发酵物料进行不同部位的取样。采用10 m3/h通风量对单宁酶进行固态发酵,如图5(a)所示,单宁酶酶活随发酵时间的增加而增大,96 h时达到最大值8.21 U/g ds。此后酶活略有降低,可能是由于培养过程中营养物质的消耗及有毒物质的积累影响了微生物的酶性[12-13]。此外,生物量也随着发酵时间的增加而增长,在72 h达到最大值225.27 mg/g ds。72 h后较高的发酵温度和降低的含水量共同阻碍了菌体的生长,并延缓了代谢产物的产生,其固态发酵产单宁酶的过程符合产物形成与菌体生长属于部分偶联型的关系[14]。

由图5(b)可知,开始发酵的前24 h,微生物的生长使品温上升;通风后的降温效果明显,但热量随风的流动被带出培养基质时,也带走一部分水分,表现为培养基内部温度、水分含量下降。同时,通风为微生物的生长带来了充分的氧气,极大地促进了微生物的生长,微生物代谢及产热旺盛,品温上升趋势明显,高的温度影响微生物的生长,表现为代谢减缓。随后,微生物的生长进入平稳期,温度维持在一个平衡状态。微生物的生长、产生的热量和通风使得物料中的水分含量急剧降低,当发酵时间达96 h时,物料含水率低于60%,为保证发酵过程中物料的湿度,对物料进行喷洒增湿,使96 h后的水分含量上升。

图5 10 m3/h通风量下单宁酶活力与生物量(a)和发酵温度与含水量(b)的变化曲线Fig.5 Changes of tannase activity and biomass(a)，temperature and moisture(b)under the aeration rate of 10 m3/h

2.2.2 15 m3/h通风量条件下的试验结果 采用15 m3/h通风量对单宁酶进行固态发酵,如图6所示。由图6(a)可知,在整个发酵过程中,单宁酶随着发酵时间的延长而不断积累,120 h单宁酶活达到最大8.08 U/g ds(靠近通风口的A处)。可能是由于通风对A点的降温效果高于B和C点,使得A点微生物生长代谢较快,相同时间内积累的单宁酶较多。由图6(b)可知,A、B、C处微生物的生长具有相似的趋势,但分别在72 h(A点和C点)和96 h(B点)达到最大生物量。在整个培养箱中微生物生长不同步可能是由于各部分温度具有差别。

图6 15 m3/h通风量下单宁酶活力(a)、生物量(b)、物料含水量(c)和发酵温度(d)变化曲线Fig.6 Changes of tannase activity(a),biomass(b),substrate moisture(c)and temperature(d)under the aeration rate of 15 m3/h注:A、B、C分别表示取样点在靠近通风口处、培养箱中部和远离通风口的位置;TA-1、TB-1、TC-1分别表示测温点在靠近通风口处、培养箱中部和远离通风口的料层上层;TA-2、TB-2、TC-2在靠近通风口处、培养箱中部和远离通风口的料层中层;TA-3、TB-3、TC-3分别表示测温点在靠近通风口处、培养箱中部和远离通风口的料层下层;图7同。

由图6(c、d)可知,由于风在流动过程中损失,在到达C点位置时风量及分压很小,使通过料层的气流减小,影响了该点处物料的散热而导致热量积累,使C点中部在发酵36 h时达到最高温度46.5 ℃;同时,也使C点的水分蒸发量大于靠近风口的A处和中部的B处,表现为增湿后在96 h时的水分含量快速降低。

2.2.3 20 m3/h通风量条件下的试验结果 采用20 m3/h通风量对单宁酶进行固态发酵,如图7所示。由图7(a)可知,在整个发酵过程中,单宁酶酶活随发酵时间的延长而不断增加。在144 h时单宁酶酶活达到最大值8.41 U/g ds(最大酶活仍出现在靠近通风口的A处),且仍具有上升的趋势。但144 h时C点最大酶活仅为5.45 U/g ds,原因是气体在稳压层内压力流动过程中,由于压力损失和静压的增长会使在培养箱远离出风口的C点的出气流无法正常通过料层,导致无法有效地控制温度,严重影响微生物的生长,同时会引起发酵过程中水分含量最低(c)和发酵温度最高(d)都出现在远离通风口的C点。

图7 20 m3/h通风量下单宁酶活力(a)、生物量(b)、物料含水量(c)和发酵温度(d)变化曲线Fig.7 Changes of tannase activity(a),biomass(b),substrate moisture(c)and temperature(d)under the aeration rate of 20 m3/h

2.2.4 10、15、20 m3/h通风量对单宁酶发酵效果的对比 将不同通风量条件下的发酵结果进行对比分析,如表1所示。在通风量为10、15、20 m3/h的发酵过程中,发酵所达到的最大酶活相近,但达到最大酶活的时间具有显著性差异(P<0.05),表明通风量在10～20 m3/h的范围内对单宁酶发酵的影响不大,虽然较强的通风对发酵过程中温度的调节作用更为明显,但在流经料层时不仅带出热量,也使其携带更多水分,影响了微生物的生长,使达到最高生物量和最大酶活的时间延后。发酵中最大酶活均在生物量达到最大值之后达到,说明随着菌体数量的增长,单宁酶在不断的积累;酶活达到最大值后开始有所下降,可能是由于随着发酵时间的延长,培养基营养成分消耗,剩余的营养物质不能满足微生物的生长代谢,从而影响了微生物的产酶[15];另外,次级代谢产物的产生,也可能会降低单宁酶的活性[16]。

表1 不同通风量条件下发酵效果比较Table 1 Comparisons of fermentation in different ventilation rates

2.3 单宁酶规模化发酵工艺的对比分析

将利用自行设计的填充床式固态发酵反应器产单宁酶的发酵结果与已有的规模化单宁酶发酵工艺进行对比分析,如表2所示。

表2 与单宁酶规模化研究的对比Table 2 Comparisons with tannase fermentation on a large scale

目前对单宁酶发酵的规模化研究较少;Beniwal等[17]以红木屑为诱导物,从湿度、碳源及培养基pH等方面对单宁酶进行固态发酵,发酵后获得最大单宁酶活力为1.84 U/g ds;Sabu等[12]以罗望子粉末以及棕榈仁饼为基质,从湿度、时间及培养基含水量等方面对单宁酶发酵生产能力进行优化研究,固态发酵条件下获得最大的酶活力为6.44 U/g ds;利用液态发酵方式产单宁酶的研究较多,但都限于三角瓶摇瓶发酵的研究,大罐培养的研究较少,可能是由于液态发酵产单宁酶所得产物多为胞内酶,进行大罐研究难度较大[18],本实验用填充床反应器以茶梗为基质进行单宁酶的中试化发酵,发酵后获得最大单宁酶活力为8.40 U/g ds,高于已有报道的最大酶活力,为后续大规模的单宁酶发酵生产应用提供了有利的参考。

3 结论

本试验确定该培养箱外形尺寸大小为1200 mm×600 mm×600 mm,由不锈钢材料制作,由鼓风机带动空气在箱体内部的循环;配置相应的喷雾、温度湿度传感器,检测发酵原料的温度和湿度;在通风量为10、15、20 m3/h的发酵过程中,发酵所达到的最大酶活分别为8.21、8.08、8.41 U/g ds,表明在该实验发酵时间内,通风量对单宁酶发酵的影响不大。但是采用较高的通风量对发酵过程中温度的调节作用更为显著,且在20 m3/h的通风量条件下,随着发酵时间增加,酶活继续上升。若以酶活为发酵指标,建议采用20 m3/h的通风量固态发酵单宁酶。最大酶活分别在靠近入风口的A点(15 m3/h)和B点(20 m3/h),最高温度均出现先远离通风口的C点中部,说明供风量不均匀,稳压层的设计不合理,应该进一步改进设备。