四种方法提取的黄花菜挥发性物质及残渣结构分析

陆海勤1,陈淋转1,张昆华1,李毅花1,杨日福2,李 文

(1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004; 2.华南理工大学物理与光电学院,广东广州 510640; 3.广西民族大学化学化工学院,广西林产化学与工程重点实验室,广西南宁 530008)

黄花菜(HemerocaliscitrinaBaroni)又称萱草、忘忧草,是一种多年生的单子叶草本植物,广泛地分布在俄罗斯、蒙古、中国、韩国等地。黄花菜富含蛋白质、维生素和矿物质,具有清热明目、抗菌消炎、镇静安眠、健脑抗衰、缓解抑郁、养血平肝和降血脂的功效,在我国作为食疗食品已有3000多年的历史。此外,黄花菜还可作为观赏花卉,品种繁多,且具有独特的香气。已有研究表明,鲜黄菜花中的挥发性香气成分有48种[1]。

植物有效成分传统的提取方法主要有热水提取法[2]、酸碱提取法[3]等,但耗时长,提取率低。目前植物有效成分的提取方法有酶辅助提取法[4]、超声辅助提取法[5]、微波辅助提取法[6]、脉冲电场提取法[7]、超临界流体萃取法[8]、超高压提取法[9]等。不同辅助提取法的协同作用不仅可以结合多种提取方法的优点,而且可以弥补单种提取方法的不足,是目前植物提取的研究趋势之一。常见的方法有微波辅助酶法[10]、超声辅助酶法[11]、微波辅助亚临界水法[12]、超声强化亚临界水法[13]等。超声辅助和电场辅助是提取天然产物的有效手段,超声波的空化效应、机械振动、微射流等多极效应,能够破坏植物细胞的细胞壁,使有效物质易从原料中溶出[14-16],具有时间短、效率高等优点;电场辅助提取则是能够使细胞膜变薄,加快细胞内容物的扩散,从而强化传质,增大提取效率。将超声场与高压静电场协同作用,可增加植物细胞的破碎率及提高提取物质的扩散速度,可进一步提高提取效率。

顶空固相微萃取(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)是一种快速、简单、无需溶剂的吸附提取香气物质的方法[17-18],在香气分析中得到广泛应用。如Ding X F等[19]用固相微萃取与气相色谱-质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析浓香型白酒,泸州酒在不同条件下的香气成分。Lv H P[20]等利用固相萃取联用气相色谱-闻香器(Gas chromatography-olfactometry,GC-O)和GC-MS分析普洱茶的香气活性成分。Kang K M等[17]用同步蒸馏萃取(Sync distillation and solvent extraction,SDE)、吹扫法与固相微萃取联用GC-O分析韩国红辣椒酱的香气。

现阶段关于超声协同电场提取天然产物的文献较少,本研究采用超声协同高压静电场提取黄花菜提取液中的挥发性物质,对比研究黄花菜提取液在60 ℃水、超声场、高压静电场不同的提取条件下挥发性物质的提取效果,采用HP-SPME联用GC-MS检测分析花黄菜提取液中挥发性物质,并分析不同提取条件下黄花菜提取液残渣的分子结构,初步探究超声协同高压静电场的提取机理。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品黄花菜 购于上海裕田农业科技有限公司,产地为大同;无水乙醇 购自成都市科隆化学品有限公司;蒸馏水 实验室自制。

BS200S电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;GCMS-2010气相质谱联用仪 日本岛津公司;DVB 75 μm聚二甲基硅氧烷萃取头 美国Supelco公司;SB-5DTD超声波提取器 宁波新芝生物科技有限公司;DE-100高精度双极高压静电场发生器 大连鼎通科技有限公司;DKB-10数显智能低温恒温循环器 宁波新芝生物科技有限公司。

在实验室组装超声协同静电场提取装置,提取设备示意图见图1。

1.2 实验方法

1.2.1 黄花菜的预处理 将黄花菜在50 ℃烘24 h,将已烘干的黄花菜粉碎后过60目筛,加入无水乙醇浸泡,磁力搅拌24 h后抽滤,50 ℃下干燥24 h,即得试验用黄花菜干粉[21],装袋密封冷藏待用。

1.2.2 黄花菜干粉挥发性物质提取方法 在最佳提取工艺(提取时间30 min,提取温度60 ℃,超声功率700 W,电场电压14 kV,液料比(水∶黄花菜干粉)25 mL/g,脉冲频率1/600 s-1)的基础上设计实验方案[22-23]。采取60 ℃水提取、超声提取、高压静电场提取和超声协同高压静电场提取四种方法来提取黄花菜干粉中的挥发性物质。提取装置如图1。

图1 超声协同静电场提取黄花菜挥发性物质装置示意图Fig.1 Schematic diagram of ultrasound combined with electric field assisted-extraction device注:1：高精度双电极静电场发生器;2：时间控制器;3:超声波发生器;4:被绝缘玻璃包裹的电极;5:密封橡胶塞;6:锥形瓶;7:超声水浴槽;8:恒温循环器;9:超声波换能器。

60 ℃水提取:称取2.00 g黄花菜干粉,加入50 mL蒸馏水,在60 ℃水中提取30 min。

超声提取:称取等量的黄花菜干粉,加入等量的蒸馏水,在温度60 ℃、超声功率700 W下提取30 min。

高压静电场提取:称取等量的黄花菜干粉,加入等量的蒸馏水,在温度60 ℃、脉冲频率1/600 s-1、电场电压14 kV下提取30 min。

超声协同高压静电场提取:称取等量的黄花菜干粉,加入等量的蒸馏水,在温度60 ℃,超声功率700 W、电场电压14 kV和脉冲频率1/600 s-1下超声协同电场提取30 min(最佳工艺条件)。

1.2.3 挥发性物质成分分析 SPME[24]条件:取黄花菜干粉1 g或提取后的黄花菜干粉溶液5 mL,转移至15 mL顶空瓶中,用DVB 75 μm萃取头在80 ℃条件下吸附30 min,插入GC进样口,解吸5 min。

GC[25]条件:色谱柱:DB-FFAP石英毛细柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气为氦气;进样口温度:230 ℃,不分流进样。升温程序:起始温度35 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升至170 ℃,保持3 min,再以5 ℃/min升至220 ℃,保持2 min,再以3 ℃/min升至230 ℃,保持7 min。

MS条件:质谱条件:接口温度230 ℃,离子源温度230 ℃,电子能量70 eV,质量扫描范围m/z 35～500。

1.2.4 提取后残渣的结构观察(SEM) 将提取后的黄花菜提取液3000 r/min离心15 min[21],收集离心后得到的黄花菜残渣,冷冻干燥后,用扫描电子显微镜观察黄花菜残渣的组织形态。

1.2.5 数据分析 根据图谱库(NIST14.L)对组分定性,并计算各化学成分的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 黄花菜及提取液挥发性物质组成

黄花菜及提取液中挥发性物质的GC-MS总离子流图见图2～图6,共检测出挥发性成分96种,其中醇类9种、醛类14种、酮类18种、酯类9种、烷烃类11种、烯烃类7种、羧酸类9种、酚类3种、其他类16种。检索出黄花菜及提取液的挥发性物质见表1。

图2 黄花菜挥发性物质GC-MS总离子流图Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of dried H. citrina volatile components

图3 黄花菜60 ℃水提取液挥发性物质GC-MS总离子流图Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in H. citrina extract by water extraction at 60 ℃

图4 黄花菜超声提取液GC-MS总离子流图Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in H. citrina extract by ultrasonic extraction

图5 黄花菜高压静电场提取液挥发性物质GC-MS总离子流图Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in H. citrina extract by electrostatic field extraction

图6 黄花菜超声协同高压静电场提取液挥发性物质GC-MS总离子流图Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in H. citrina extract by electrostatic field extraction

由表1可知,黄花菜干粉中有60种挥发性物质(总质量分数99.99%),其中醇类6种(28.06%),醛类6种(11.86%),酮类10种(14.34%),酯类3种(4.85%),烷烃类8种(7.12%),烯烃类6种(7.47%),羧酸类9种(16.00%),酚类3种(2.10%),其他9种(8.19%)。相对含量较高(>1%)的有:3-呋喃甲醇(19.12%)、5-羟甲基糠醛(6.03%)、橙花叔醇(4.86%)、正己酸(4.67%)、3,5-二羟基-5-烯烃-6-甲基吡喃-4-酮(4.60%)、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(4.30%)、乙酸(3.50%)、2-甲基呋喃(3.50%)、呋喃甲醛(3.34%)、2-甲基呋喃(3.37%)、(E)-β-金合欢烯(2.90%)、二氢猕猴桃内酯(2.53%)、正二十烷(2.14%)、3-呋喃甲酸(2.10%)、1-辛烯-3-醇(1.56%)、正十五烷(1.43%)、3-呋喃甲基乙酸酯(1.38%)、辛酸(1.36%)、2-庚烯酸(1.33%)、α-法尼烯(1.31%)、(E)-2,6-二甲基-2,6-十一碳二烯-10-酮(1.13%)、6-甲基-3,5-戊二烯-2-酮(1.12%)、2,6-二叔丁基对甲苯酚(1.07%)、苯乙醇(1.02%)、壬酸(1.01%)。

表1 提取前后黄花菜的挥发性物质组成Table 1 Volatile components in drying H. citrina before and after different extraction methods

续表

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2.2 黄花菜提取液挥发性物质的比较

2.2.1 60 ℃水提取 由表1可知,比较黄花菜及60 ℃水提取液的挥发性物质,黄花菜独有组分为45种,60 ℃水提取液的独有组分为18种,相对含量为59.27%,其中醇类2种(1.66%),醛类4种(25.59%),酮类5种(6.39%),酯类3种(6.17%),烷烃类1种(1.69%),其他类3种(17.78%)。

黄花菜中挥发性物质的相对含量醇类(28.06%)>羧酸类(16.00%)>酮类(14.34%)>醛类(11.86%),而提取液中醛类(27.05%)>醇类(20.86%)>其他类(19.21%)>酮类(11.24%);60 ℃水提取液中,醛类、酯类和其他类物质组分明显增加,醇类、酮类、烷烃类、烯烃类的含量有所下降,羧酸类的含量急剧降低;60 ℃水提取液挥发性物质还保留着主体成分,但是单一组分的种类明显减少。从单一组分来看,60 ℃水提取液显著增加的物质有橙花叔醇、2,6-二叔丁基对甲酚等,明显减少的成分有3-呋喃甲醇;60 ℃水提取液新生成的挥发性物质中含量较高的有(E,E)-2,4-壬二烯醛(13.33%)、3-甲基呋喃(10.72%)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(8.29%)等。

黄花菜在60 ℃水后,提取液中的挥发性物质发生了显著的变化。在60 ℃水的加热作用下,黄花菜颗粒产生了醇类、醛类、酮类和酯类等化合物。温度的升高还使得水中氢键的缔合程度下降[26],部分氢键断裂产生了·H和·OH。黄花菜中的部分成分可能会溶于水,或者接受·H或·OH,发生更为复杂的反应,产生新的物质溶于水中。黄花菜颗粒中溶于水中的物质还有可能在60 ℃的温度下受热分解,产生新的挥发性物质。总的来说,60 ℃水提取后,黄花菜提取液中形成了新的挥发性物质,挥发性物质的组成种类有所减少。

2.2.2 超声提取 与黄花菜相比,黄花菜中挥发性物质有60种,超声提取液中仅有44种,挥发性物质的种类数量降低,其中烷烃类、羧酸类的种类大幅减少,醇类、酮类和酚类的种类略有减少,醛类、酯类和其他类的挥发性物质种类有所增加;黄花菜中醇类、羧酸类、酮类和醛类相对含量所占比重为醇类(28.06%)>羧酸类(16.00%)>酮类(14.34%)>醛类(11.86%);超声提取液中挥发性物质相对含量醛类(20.16%)>醇类(15.88%)>酯类(15.77%)>其他类(15.68%)>酚类(12.64%)>酮类(11.80%)。超声提取时,超声的空化效应使黄花菜颗粒溶于水中的不稳定物质降解成小分子物质,并明显促进酯化反应的进行,与黄花菜相比,超声提取液中挥发性物质醛类、酯类、酚类相对含量大幅增加,酮类、烯烃类略有降低,醇类、烷烃类、羧酸类相对含量明显降低。

2.2.3 高压静电场提取 与60 ℃水提取和超声提取相比,高压静电场提取液中黄花菜挥发性物质的种类和数量均锐减。从表1中可以看出,与前两种提取方式相比,高压静电场提取后,挥发性物质的相对含量酯类(41.55%)>烷烃类(18.29%)>酮类(16.81%)>醛类(10.19%),酯类占据的比重最大。这种现象的产生与高压静电场对反应体系的作用有关。高压静电场能够破坏反应体系中溶胀的黄花菜颗粒分子之间的电子结合力,使颗粒结构变得更加疏松,更容易破碎,增大了固体的比表面积,在高压静电场的作用下,带电荷的粒子定向运动,强化了反应体系中液体的湍动效应,从而增大了传质系数,强化了传质过程,促进了黄花菜颗粒中的离子和其他大分子物质流出[27-28];在电场力的作用下,水分子和带电粒子诱导变形,能级和反应活性较高,能够反应生成其他化合物。从酯类在挥发性物质中的相对含量较高可以看出,电场对于酯化反应具有显著的促进作用。

2.2.4 超声协同高压静电场提取 由表1可知,超声协同高压静电场提取液中黄花菜挥发性物质的相对含量醇类(20.24%)>酯类(18.85%)>酮类(18.14%)>酚类(15.65%)。超声协同高压静电场提取与超声提取相比,挥发性物质中醇类、酯类、烷烃类、酚类的相对含量都有所增加,而醛类、烯烃类的相对含量则显著降低,这可能跟醛类和烯烃类物质的化学性质比较活泼有关。在超声协同高压静电场提取过程中,各挥发性物质的相对含量发生了显著的变化,这与超声和高压静电场之间的协同效应有关。超声波的作用使水分子不断裂解为·H和·OH[29-30],甚至产生H2O2。反应过程中,黄花菜颗粒中溶出的不稳定的烯烃类物质跟体系中不断产生的·H等自由基发生反应,因而相对含量降低;高压静电场会使水分子和带电的黄花菜颗粒极化[27],不断交换方向的高压脉冲静电场,使带电粒子产生往返的定向运动,增大了粒子的碰撞几率,有利于粒子的反应。同时电场力的作用使空化泡沿场强方向拉伸[28],加剧了空化泡内部的运动,强化了空化效应。空化效应的增强,给烯烃类物质的加氢反应提供了活化能,从而生成了饱和度较高的烷烃,使烷烃类物质的相对含量增加,与表1中的数据一致。醛类物质的反应活性比较强,R-CHO中的醛基(-CHO)能够发生氧化或还原反应,转化成羧基(-COOH)或羟基(-OH),又可以发生酯化反应,这可能是超声协同高压静电场提取与超声提取相比,提取液中挥发性物质醇类、酯类和酚类的相对含量都有所增加的原因。

2.3 结构观察

用扫描电子显微镜观察提取后的黄花菜固体残渣的结构形态。由图7中黄花菜原料提取前后的扫描电子显微镜图谱可知,提取前黄花菜原料的分子形态(图7A)呈比较完整的块状,没有明显的空洞;60 ℃水提取后,黄花菜原料的颗粒表面开始出现一些比较规则的网状的结构(图7B)。在60 ℃水的作用下,黄花菜原料的表面部分溶解,水仅仅是侵蚀了原料的表层,并未对其结构造成实质性的破坏。超声提取后,黄花菜原料的组织形态发生破裂,出现很多比较规则的圆形或椭圆形的空洞状结构(图7C)。高压静电场提取后,黄花菜的组织被部分破坏,呈现褶皱状,还有一些比较浅显的不规则空洞,但是与超声提取不同的是空洞相对较小,空洞边缘的厚度比较薄(图7D);超声协同高压静电场提取后,黄花菜的组织被完全破坏,出现很多半径较大,褶皱较深的空洞,这些孔洞厚度比较薄,有的空洞之间已经相互连通(图7E)。不同提取方式对黄花菜原料的破损程度:超声协同电场提取>超声提取>电场提取>60 ℃水提取。超声协同电场提取比超声提取对黄花菜组织的作用更加强烈,超声空化作用产生的空化泡的溃裂形成的高速微射流对原料的表面反复冲击,导致组织破碎,形成空洞,使有效成分大量溶出。静电场的感应产生的极化现象,强化了体系的湍动效应[31],打薄了黄花菜组织中形成的空洞。超声场和高压静电场的协同效应,相辅相成,大大提高了传质的效率,可以更大程度地使黄花菜组织中的有效成分溶出。

图7 黄花菜原料提取挥发性物质前后的扫描电子显微镜图谱Fig.7 SEM images of the residue by different extraction methods注:A:黄花菜原料;B:60 ℃水提取后的残渣;C:超声提取后的残渣;D:高压静电场提取后的残渣;E:超声协同高压静电场提取后的残渣。

3 结论

黄花菜干粉中有60种挥发性物质(见表1),其中醇类6种(28.06%),醛类6种(11.86%),酮类10种(14.34%),酯类3种(4.85%),烷烃类8种(7.12%),烯烃类6种(7.47%),羧酸类9种(16.00%),酚类3种(2.10%),其他9种(8.19%)。而60 ℃水提取液中挥发性物质相对含量醛类(27.05%)>醇类(20.86%)>其他类(19.21%)>酮类(11.24%);超声提取液中挥发性物质相对含量醛类(20.16%)>醇类(15.88%)>酯类(15.77%)>其他类(15.68%)>酚类(12.64%)>酮类(11.80%);高压静电场提取液中挥发性物质的相对含量酯类(41.55%)>烷烃类(18.29%)>酮类(16.81%)>醛类(10.19%);超声协同高压静电场提取液中挥发性物质的相对含量醇类(20.24%)>酯类(18.85%)>酮类(18.14%)>酚类(15.65%)。综合来看,超声协同高压静电场提取相比于其他三种提取方法,黄花菜干粉中的主要挥发性物质醇类、醛类、酮类和酚类等能够更有效地提取出来且含量升高并稳定。用扫描电子显微镜观察提取后的黄花菜固体残渣,可知不同提取方法对黄花菜原料的破损程度不同:超声协同高压静电场提取>超声提取>高压静电场提取>60 ℃水提取。超声协同高压静电场提取比超声提取对黄花菜组织的作用更加强烈:超声空化作用使组织破碎,形成空洞,使有效成分大量溶出;静电场的极化作用,强化了体系的湍动效应,打薄了黄花菜组织中形成的空洞;超声场和高压静电场的协同效应,提高了传质的效率,可以促进黄花菜组织中有效成分的溶出。