温度和盐度胁迫下虹鳟和硬头鳟抗应激能力的比较❋

吴仓仓， 付占斐， 王 芳❋❋， 董双林

(1.海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)， 山东 青岛 266003； 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266235)

应激是指机体面对环境刺激时的一系列非特异性反应[1]。正常来说，应激反应作为一种适应性机制可以让机体处理应激源，以维持稳定状态[2]。但是，长时间或剧烈应激反应对机体有害[3]。研究发现，温度[4]、盐度[5]、溶氧[6]和pH[7]等变化会引起鱼类产生应激反应。温度变化直接影响鱼类摄食、代谢和免疫等生理活动[8]，盐度波动则通过渗透压的变化影响机体的生理机能[9]。鱼类的初级应激反应中，下丘脑通过分泌促肾上腺皮质素释放激素(CRH)，促进垂体促肾上腺皮质激素释放，最终引起肾间组织分泌皮质类固醇，致使血浆中皮质醇(COR)浓度升高[3]，因此，鱼类血液中皮质醇浓度可反映应激程度[10]。研究表明，急剧的温度和盐度变化导致鱼体内产生大量的氧自由基[11]，若抗氧化系统无法及时清除积累的氧自由基，鱼类就会受到应激损伤。机体的抗氧化系统分为酶促系统和非酶促系统[12]，酶促系统主要由抗氧化酶组成，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等[13]，这3种酶形成一条链式反应，能有效将氧自由基逐步转化为H2O[14]，保护机体免受氧化损伤，因此抗氧化酶活力可以反映机体清除氧自由基的能力。氧自由基可攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物[15]，后者的分解产物，如丙二醛(MDA)含量可直接反映机体脂质过氧化程度和细胞受损程度[16]。

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)属于陆封型鱼类，终年生活在河流湖泊中，硬头鳟(Oncorhynchusmykiss)属于洄游型鱼类，在海水中育肥，成熟后洄游至淡水中产卵。两者适宜生长的温度为12～18 ℃，最适生长温度为16～18 ℃[17]。我国从1980年代开始虹鳟的海水驯养研究[18]，国外相对早些[19]，至今已经成功实施了虹鳟和硬头鳟的海上养殖[20]。海上养殖活动时，受台风、暴雨等极端天气的影响，局部水体的温度和盐度会发生短时间的急剧下降，可对养殖鱼类造成严重胁迫[21-23]。目前，有关温度和盐度同时突变对虹鳟或硬头鳟应激生理影响的研究还未见报道。本文设置不同梯度的温度、盐度正交处理，通过分析血清中抗氧化酶活力、丙二醛及皮质醇含量的变化，查明虹鳟和硬头鳟抗应激能力的差异，以期为海上养殖结构优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验鱼的来源和驯养

虹鳟和硬头鳟均取自山东省日照市万泽丰冷水鱼苗孵化繁育基地。实验鱼运回实验室后，暂养于1.2 m3的方形水槽中。暂养用水是经曝气的自来水，水温(16±0.5)℃，溶氧≥6 mg/L，pH=7.9±0.2，每日投喂2次七好牌配合饲料(8：00,20：00)，日投喂量为鱼体重的3%(约300 g)，每日换水2次，每次换水量为50%。待鱼正常摄食后，将鱼驯化到盐度30的海水中。驯化方式为：第一天将鱼从淡水过渡到盐度为14的水中，之后每天升高2个盐度，逐渐驯化到30盐度[24]，并在此环境中适应10 d。驯化期间的管理同暂养。停止投喂24 h后，挑选体色正常，活力较好的2种鱼开始正式实验。实验鱼的规格：虹鳟：体长(15.65±1.02) cm，体质量(52.14±7.22) g；硬头鳟：体长(16.03±0.93) cm，体质量(54.38±6.32) g。

1.2 实验设计

海洋环境变化的相关资料显示[25-29]，遭遇台风等极端天气时海区水温可突降2～8 ℃，局部盐度突降3～10。据此，本实验设置了3个温度水平(13、10和7 ℃)和3个盐度水平(27、24和21)的双因素实验。以水温16 ℃、盐度30作为对照组(O组)，处理组分别为A组(13 ℃，27)、B组(13 ℃，24)、C组(13 ℃，21)、D组(10 ℃，27)、E组(10 ℃，24)、F组(10 ℃，21)、G组(7 ℃，27)、H组(7 ℃，24)、I组(7 ℃，21)，每个处理组设3个重复，每个重复8尾鱼放入192L(0.8 m×0.4 m×0.6 m)的实验缸中。实验过程中用循环水控温系统控温(温差控制在±0.5 ℃)。

1.3 样品采集和测定

分别于胁迫前(0 h)和胁迫后2、6、12、24和48 h采样，每个处理组每个时间点随机选取3条鱼。采样时，将鱼快速投入加有浓度为200 mg /L的MS-222的水桶中麻醉2 min，然后置于无菌冰盘上，尾静脉取血。血样在4℃静置24 h后，于4 ℃、4 000 r/min离心15 min，制备血清。血清样品放入-80 ℃冰箱中保存待测。采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)活力以及MDA和COR的含量。

1.4 数据处理

利用SPSS(Version 21)软件，以盐度和温度作为自变量，进行双因素方差分析(Two-Way ANOVA)，如果两个自变量间存在显著的交互作用，则进行简单主效应分析；如果自变量间不存在显著的交互作用，则进行主效应分析。用Duncan氏法进行多重比较。统计结果用平均值±标准差(Mean±SD)来表示，以P<0.05作为差异显著水平。

2 结果

2.1 温度和盐度胁迫对虹鳟血清抗氧化酶活力、MDA和COR含量的影响

温度和盐度突变2 h时，两者的交互作用对虹鳟血清GSH-PX活力和MDA含量有显著影响(P<0.05)，温度对其抗氧化酶活力、MDA和COR含量有显著影响(P<0.05)，盐度对其MDA含量有显著影响(P<0.05)(见表1)，主效应分析显示：7 ℃下的虹鳟血清SOD和CAT活力，以及COR含量最高(见表2)；突变6 h时，温度和盐度的交互作用对虹鳟SOD活力有显著影响(P<0.05)，温度对其SOD和GSH-PX活力以及COR含量有显著影响(P<0.05)(见表1)，主效应分析显示：7 ℃下虹鳟血清中GSH-PX活力显著高于其他温度水平，10 ℃下COR含量显著高于其他温度水平(P<0.05)(见表2)；突变12 h时，温度和盐度的交互作用对虹鳟CAT活力有显著影响(P<0.05)，温度对SOD、CAT和GSH-PX活力有显著影响(P<0.05)，盐度对SOD活力有显著影响(P<0.05)(见表1)，主效应分析显示：7℃下虹鳟SOD、GSH-PX活力显著高于其他温度水平，盐度21和盐度24下SOD活力显著高于盐度27(P<0.05)(见表2)；突变24 h时，温度和盐度的交互作用不明显(P>0.05)，温度对SOD和GSH-PX活力，以及MDA含量有显著影响，盐度对GSH-PX活力和MDA含量有显著影响(P<0.05)(见表1)，主效应分析显示：7和1 0℃下虹鳟血清中SOD活力和MDA含量显著高于13℃，7℃下GSH-PX活力显著高于其他温度水平，盐度21下GSH-PX活力显著高于盐度27(P<0.05)(见表2)；突变48h时，温度和盐度的交互作用对COR含量有显著影响(P<0.05)，温度对MDA和COR含量有显著影响(P<0.05)，盐度对CAT活力有显著影响(P<0.05)(见表1)，主效应分析显示7℃下MDA含量显著高于10℃(P<0.05)，盐度24下CAT活力显著高于21盐度(P<0.05)(见表2)。

温度和盐度突变2 h后，虹鳟血清SOD活力升高，6 h后开始下降，各时间点SOD活力无显著差异；CAT和GSH-PX活力在胁迫2 h内均升高，随后逐渐下降，在24和48 h时均再度升高。MDA含量在胁迫开始2 h内急剧上升，随后下降；COR含量从胁迫开始后上升到较高水平，随后保持缓慢上升状态，直到胁迫48 h(见表2)。对照组48 h内无显著变化。

2.2 温度和盐度胁迫对硬头鳟血清抗氧化酶活力、MDA和COR含量的影响

温度和盐度突变2 h时，两者的交互作用对硬头鳟血清SOD、CAT和GSH-PX活力有显著影响(P<0.05)，温度对抗氧化酶活力、MDA和COR含量均有显著影响(P<0.05)，盐度对SOD活力有显著影响(P<0.05)(见表3)，主效应分析显示：7和10 ℃下硬头鳟血清中MDA含量显著高于13 ℃(P<0.05)，7和13 ℃下COR含量显著高于10 ℃(P<0.05)(见表4)；突变6h时，温度和盐度的交互作用对COR含量有显著影响(P<0.05)，温度对SOD、CAT和GSH-PX活力有显著影响(P<0.05)，盐度对GSH-PX活力有显著影响(P<0.05)(见表3)，主效应分析显示：7 ℃下SOD、CAT活力最高，13 ℃下GSH-PX活力显著高于7 ℃(P<0.05)，盐度27下GSH-PX活力显著高于盐度21(P<0.05)(表4)；突变12 h时，双因素分析结果和温度效应的影响与6 h相同，盐度对COR含量有显著影响(P<0.05)(见表3)，主效应分析显示：7 ℃下SOD和CAT活力最高，7和10 ℃下GSH-PX活力显著高于13℃(P<0.05)(见表4)；突变24 h时，温度和盐度交互作用不明显(P>0.05)，温度对SOD和CAT活力有显著影响(P<0.05)，盐度对COR含量有显著影响(P<0.05)(见表3)，主效应分析显示：7 ℃下SOD和CAT活力显著高于其他温度水平(P<0.05)，盐度27下COR含量显著高于盐度21(P<0.05)(见表4)；突变48 h时，温度和盐度交互作用对COR含量有显著影响(P<0.05)，温度对抗氧化酶活力和COR含量有显著影响(P<0.05)，盐度对COR含量有显著影响(P<0.05)(见表3)，主效应分析显示：7℃下SOD、CAT活力显著高于其他温度水平(P<0.05)，10 ℃下GSH-PX活力显著高于7 ℃(P<0.05)(见表4)。

温度和盐度突变12 h内，硬头鳟血清中SOD、CAT和GSH-PX活力，以及MDA含量呈先上升后下降的趋势，突变12或24 h时呈现再次上升，随后又下降的变化趋势；血清COR含量在胁迫开始后先上升，随后逐渐降低(见表4)。对照组在各时间点均无显著变化。

2.3 温度和盐度胁迫下虹鳟和硬头鳟抗应激能力的比较

温度和盐度胁迫下虹鳟和硬头鳟抗应激能力的比较如图1所示。图1A的雷达面积图是将不同处理组不同采样点的虹鳟和硬头鳟血清应激指标取均值绘制而成。从图中可以看出各个指标随胁迫时间持续的大致变化趋势，还能纵向比较虹鳟和硬头鳟各指标同一时间点下的高低状况。图1B是将对照组(虹鳟O、硬头鳟O)、处理组(虹鳟T、硬头鳟T)所有采样点下的各个指标取均值，进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)的结果。从图1B可以看出，虹鳟对照组和硬头鳟对照组各个指标间无显著差异(P>0.05)，但是均显著低于相应的处理组(P<0.05)。虹鳟和硬头鳟处理组血清SOD活力在每个时间点下变化趋势较小(见图1A)，无显著差异(P>0.05)(见图1B)。硬头鳟处理组血清CAT和GSH-PX活力在每个时间点下基本都高于虹鳟处理组(见图1A)，均显著高于虹鳟处理组(P<0.05)(见图1B)。虹鳟处理组血清MDA和COR含量总体上则显著高于硬头鳟处理组(P<0.05)(见图1B)。

3 讨论

3.1 温度和盐度胁迫对虹鳟和硬头鳟应激的影响

温度、盐度作为鱼类生活环境中极其重要的因子，二者的变化均会对鱼体产生直接的影响[30-31]。本研究发现，温度和盐度胁迫的交互作用对虹鳟和硬头鳟的SOD、CAT和GSH-PX活力，及COR含量有显著影响(P<0.05)，而变化规律不一致；对虹鳟SOD、CAT、GSH-PX活力的交互作用出现在2～12 h，而硬头鳟则在2 h时出现，表明在胁迫初期，虹鳟和硬头鳟产生剧烈的应激反应。郭勤单等[32]研究发现，环境变化1 d时，温度和盐度对褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼鱼肝脏SOD和CAT活力，及MDA含量有显著的交互作用，而环境变化6 d后，交互作用不明显，这与本实验结果相似。在本实验中，温度和盐度交互作用不显著时，温度突变48 h内，虹鳟和硬头鳟抗氧化酶活力、MDA和COR含量均产生显著变化，主效应分析显示7 ℃时的指标水平多显著高于10和13 ℃的水平，说明虹鳟和硬头鳟能耐受的降温幅度不宜过大，否则会引起较为剧烈的应激反应。相比之下，盐度对虹鳟和硬头鳟应激指标出现显著影响的情况较少，且主效应分析显示，不同盐度水平间的差异未见一致，这可能与胁迫前的盐度驯化有关[33]。总体来看，在温度和盐度同时下降时，虹鳟和硬头鳟对温度变化的应激反应较盐度敏感，这与强俊等[34]对尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)幼鱼的研究结果一致。

3.2 温度和盐度胁迫下虹鳟和硬头鳟抗应激能力的比较

温度和盐度急剧变化会导致鱼体内氧自由基的大量积累，对机体造成氧化损伤。对于短时间的氧化应激，鱼体会快速合成SOD、CAT、GSH-PX等抗氧化酶来及时清除氧自由基，若是面对长期的环境因子胁迫，

表1温度和盐度胁迫下虹鳟各应激指标双因素方差分析结果
Table 1 Two-way ANOVA analysis on stress indexes under temperature and salinity stress of rainbow trout

表2不同胁迫时间下各处理组虹鳟应激指标多重比较结果
Table 2 Multiple comparisons of rainbow trout stress indexes in various treatment groups under different stress times

续表2

表3温度和盐度胁迫下硬头鳟各应激指标双因素方差分析结果
Table 3 Two-way ANOVA analysis on stress indexes under temperature and salinity stress of steelhead trout

表4不同胁迫时间下各处理组硬头鳟应激指标多重比较结果
Table 4 Multiple comparisons of steelhead trout stress indexes in various treatment groups under different stress times

续表4

(图1A中T0、T1、T2、T3、T4、T5分别代表实验中取样时间点0、2、6、12、24和48 h。雷达图圈的单位为应激指标相对值，数值为每个指标值与同一时间点该鱼该项指标最大值的比值。图1B中纵坐标单位和上述比值相同，虹鳟O、硬头鳟O、虹鳟T和硬头鳟T分别代表虹鳟对照组、硬头鳟对照组、虹鳟处理组和硬头鳟处理组。不同小写字母表示同一指标下不同组之间具有显著差异(P<0.05)。In
Figure 1A, T0, T1, T2, T3, T4 and T5 represent the sampling time points 0 h, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h and 48 h, respectively. The unit of the radar circle is the relative value of the stress index, and the value is the ratio of each index value to the maximum value of the fish at the same time point. In
Figure 1B, the ordinate unit is the same as the above-mentioned ratio, rainbow trout O, steelhead trout O, rainbow trout T, and steelhead trout T represent the rainbow trout control group, the steelhead trout control group, the rainbow trout treatment group, and the steelhead trout treatment group, respectively. Different lowercase letters indicate that there is a significant difference between different groups of the same indexes (P<0.05).)

图1 温度和盐度胁迫下虹鳟和硬头鳟抗应激能力的比较
Fig.1 Comparison of anti-stress ability of rainbow trout and steelhead trout under temperature and salinity stress

将消耗大量的能量[35]，并且很难维持内环境的稳态，免疫力下降[36]，甚至导致死亡。海上养殖遇到台风暴雨天气时，水体温度和盐度急剧下降，这种台风导致的低温低盐伴随台风很快出现，但却不会随台风消失而很快恢复，因为海水的升温、交汇是一个缓慢的过程[37]。因此，这种情况下，长期胁迫的生理恢复能力非常重要。研究表明，水温、盐度急剧下降时，鱼肝、肾、心和鳃等组织细胞膜的脂流动性和弹性减弱，容易造成细胞膜破损渗漏或通透性增加，胞内溶质外流入血，引起鱼的血清生化指标变化[38]。本实验结果显示，水温、盐度突降后，虹鳟和硬头鳟的SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA含量均先上升后下降，表明鱼体产生应激反应，体内产生大量的氧自由基，抗氧化系统合成更多的SOD、CAT、GSH-PX等以清除氧自由基。随着氧自由基的清除，MDA含量逐渐下降。然而，在胁迫过程中上述指标仍然有波动的情况，其中虹鳟和硬头鳟的SOD、CAT、GSH-PX活力在12或24 h均开始出现回升，硬头鳟的MDA含量在胁迫后期同样也出现了上升，并且胁迫48 h内始终高于突变前水平，表明鱼体内应激反应仍在进行。虽然机体通过谷胱甘肽和含巯基氨基酸的还原及醛氧化酶的氧化等防御性措施来代谢MDA[39]，然而在长时间的应激状态下，代谢效果有限[40]。一般情况下应激过程中机体血清COR含量上升，当机体适应后，其含量逐渐下降[41]。本实验结果发现：虹鳟和硬头鳟血清COR含量在胁迫开始后上升，胁迫期间内也并未恢复到胁迫前的水平，并且显著高于胁迫前水平。综上可以得出，温度、盐度持续胁迫下，虹鳟和硬头鳟体内的抗氧化反应持续进行，在胁迫48 h内鱼体未能完全适应环境变化，始终处于应激状态。

虹鳟和硬头鳟属于同种鱼类，而自然环境下的虹鳟(陆封型)和硬头鳟(洄游型)则具有不同的生态类型，二者在生长、发育、繁殖性能[42]以及基因[43]等方面有差异。本实验结果发现，在同样的温度、盐度胁迫下，硬头鳟的抗氧化酶活性总体上显著高于虹鳟，而虹鳟血清MDA含量显著高于硬头鳟，由此可以看出：在本实验条件下，硬头鳟清除自由基的能力相对高于虹鳟，较低的MDA含量也表明其氧化损伤较轻。有研究发现，鱼类应激时皮质醇的持续升高会降低鱼类的免疫能力和抗病力[10]，持续胁迫下鱼类的存活受到显著影响。从雷达图(见图1A)中可以看出，胁迫过程中虹鳟血清COR含量始终处于上升趋势，而硬头鳟血清COR含量在胁迫后期下降，并且始终显著低于虹鳟，表明硬头鳟在胁迫后期应激反应有所缓和，而虹鳟的应激强度一直较高。陈强等[44]在比较陆封型和洄游型香鱼(Plecoglossusaltivelis)体肾组织的蛋白质组学差异时发现，陆封型香鱼对环境应激比洄游型香鱼更为敏感，二者的应激相关蛋白含量有显著差异，这也从更深层次印证了本实验结果的合理性。综上可初步得出结论，在本实验条件下，温度、盐度胁迫时硬头鳟抗应激能力强于虹鳟。