微小核糖核酸与肺动脉高压的研究进展

刘一凡 刘迎龙 顾 虹 刘玉华 司 锐 苏俊武

作者单位：261053 潍坊医学院（刘一凡）；首都医科大学附属北京安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所 小儿心脏中心（刘迎龙 顾虹 刘玉华司锐 苏俊武）

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种以肺血管阻力进行性增高为主要特征的一组疾病，如果未行有效治疗，会引起右心功能不全甚至导致死亡，其发病机制复杂、影响因素众多，至今未被清晰阐述。根据世界卫生组织对PAH的分类，分为特发性PAH、遗传相关PAH、药源（或毒源）性PAH和相关病因所致PAH[1]。据统计，仅因先天性心脏病而引发的PAH的患病率为1.6～12.5/10万[2]。由于其较高的发病率和致死率，有关PAH防治方面的研究成为了热点。肺血管重构是PAH发生的重要病理表现之一，也是其疾病发生过程中不可逆的病理特征。病变主要累及肺小、中动脉，主要由于肺动脉内皮细胞（polmnary aortic endothelial cells，PAEC）和肺动脉平滑肌细胞（pulmonary aortic smooth muscle cells，PASMC）功能异常所导致，导致具有特征性的同心圆和丛样病变形成。不论哪种类型，几乎有着共同的病理学改变：PAEC增生；肺动脉血管平滑肌细胞增生、迁移、收缩；成纤维细胞激活、增生、迁移；炎症反应。近些年对于发病机制的研究不外乎基因、后天影响和环境因素等几个方面。有研究表明，内皮素、前列腺素和磷酸二酯酶等途径均与PAH的发生发展密切相关，也因此研发了相应药物。尽管这些药物对PAH有一定的效果，但仍未能有效控制疾病发生过程中诸如细胞增殖、迁移等恶性进程，该病的死亡率仍然很高。在基因水平，针对在肺血管重构过程中，控制各组成细胞功能改变的关键靶点定位研究可能成为PAH防治方面研究的新热点。

微小核糖核酸（microRNA）是一种在广大生物体内均有表达的内源性非编码核苷酸序列，通过识别特定信使RNA（mRNA）的3′非翻译区（3′-UTR），从抑制翻译过程或影响转录物产物稳定性等方面来干扰目的蛋白质的合成。迄今为止人类基因库中约2 500个miRNAs已经被报道，这些miRNA与超过60%的人类蛋白质的编码基因相关，在整个细胞活动和人类细胞基因表达的微调中发挥关键作用。microRNA的调控作用在多种疾病的发生过程中已被证实，认为miRNA丰度平衡与内环境稳态密切相关，而对miRNA表达水平的调节可能影响诸如PAH的病理过程。事实上，已经有一系列证据表明，miRNA丰度的良好平衡对于维持肺血管系统的稳态至关重要，而miRNA水平失衡在PAH的发病机制中起着关键作用[3-4]。本综述重点关注microRNA在已明确参与PAH病理生理过程的信号通路中的功能，总结了近些年关于microRNA与PAH方面的研究进展。

1.与肺动脉高压相关的微小核糖核酸

（1）微小核糖核酸的生物合成及功能：microRNA是一类近年来发现的长约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，它存在于高等生物、植物、单细胞生物、甚至病毒当中。哺乳动物的microRNA生成是一系列复杂的过程，始于细胞核，通过两步主要的酶促反应实现。首先，microRNA的编码基因在RNA聚合酶II催化下转录，并且通过“戴帽”和“加尾”（5′端甲基化、3′端多聚腺苷酸环化）修饰后形成一条具有茎环结构的RNA片段，称为初级miRNA（pri-miRNA）其茎环结构可以被称为微处理器的蛋白质复合物识别。其次，大多数pri-miRNA在一种名为Drosha的特异性核糖核酸酶和其配体蛋白DGCR8的帮助下切割成为长度大约60个核苷酸、具发夹结构的RNA分子，称为前体miRNA（premiRNA）。这些具有发夹结构的RNA通过核输出蛋白exportin5主动转运到细胞质[5]，被另一种称为Dicer的RNase III酶在配体分子Argonaute（Ago2）、HIV-1反式激活应答RNA结合蛋白（trans-activation response ribonucleic acid binding proteins，TRBP）和/或PKR激酶蛋白激活剂（double-stranded RNA-dependent protein kinase activating protein，PACT）的协助下，最终催化产生大约22个核苷酸长度的成熟的双链microRNA[5-6]。双链miRNA中通常只有一条链参与与RNA诱导的沉默相关复合物（RISC）整合，microRNA“种子区”（seed region）的2-8个核苷酸与靶基因mRNA3′端的相应序列结合，如果mRNA与microRNA完全互补配对，mRNA则被降解；如果配对不完全，则microRNA在翻译水平抑制蛋白的生成。这表明microRNA是在转录后水平对生物过程进行调控的。

（2）与PAH相关的microRNA：关于microRNA及其在不同疾病中作用的相关研究不断增加，尤其在癌症和心血管疾病领域。事实上，在过去的几年中，已经有研究表明microRNA在心血管系统中表达的不平衡可导致各种心血管疾病的发生，肺动脉血管壁中的miRNA在维持血管稳态中发挥重要作用，这些miRNA途径的失调参与了PAH的发病机制[4，8]。

1）微小核糖核酸-21与PAH：因microRNA调节多个mRNA靶点，又根据基因在生物体内不同的细胞、组织、器官呈现特意性表达特征，据此推测microRNA的表达也具有器官、组织和细胞的特异性。miR-21定位于人的17号染色体的跨膜蛋白49（transmembrane protein 49，TMEM49）编码基因内部，该基因有独立的启动子区进行转录。miR-21作为microRNA庞大家族的一员是进些年研究的热点，其在心血管疾病中的作用也得到了充分证实。

在缺氧动物模型中，miR-21在小鼠的远端肺小动脉中表达增加[9]，同样条件下的PASMCs[9-10]和PAECs[11]中也出现了其表达增强的现象。Sarkar等发现，缺氧处理人原代PASMCs24 h后，检测发现miR-21表达上调，同时通过靶向下调程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell deaths 4，PDCD4）、Sprouty 2蛋白（SPRY2）和过氧化物酶体增殖物激活 受 体-α（peroxisome proliferators-activated receptorsα，PPARα）的基因表达，从而使PASMCs增殖与迁移增加、凋亡减少[10，12]，然而抑制miR-21表达可以防止和逆转缺氧诱导的PAH[9]。因此，可以通过评估miR-21水平来估计PASMC增殖、迁移以及PAH发展的程度[10]。在White等的研究中miR-21缺失的的小鼠PAEC中PDCD4/caspase-3轴呈激活状态并诱导产生PH。相反，在缺氧和应用SU5416（血管内皮生长因子受体抑制剂）模型中，过度表达的miR-21影响了PDCD4的表达从而避免小鼠发生PAH[13]。Pullamsetti及其同事利用缺氧小鼠和野百合碱诱导大鼠模型，研究了miR-21拮抗剂对PAH的进展和右心功能的影响。在这两种模型中，抗miR-21均能降低肺动脉的肌化程度降低右心室收缩压[14]。虽然大量研究已经证明了miR-21和PAH之间的联系，但PAH中miR-21的功能在不同的动物模型诱导方式、不同的组织细胞中可能不一致。根据Caruso及其同事报道，miR-21在野百合碱（Monocrotaline，MCT）诱导的PAH的大鼠肺中下调，但在缺氧诱导的PAH中不下调[7，10]，而在Parikh及其同事的研究中miR-21的含量在MCT处理的大鼠中出现时间依赖性的变化[7，11]。尚不清楚这种差异是否是由于不同剂量的MCT或miR-21测量过程中不同的标准化方法所致。另外，miR-21的抗PAH作用在缺氧+SU5416（选择性血管内皮生长因子受体（Flk-1/KDR）抑制剂）模型中得以验证[11，13]，但在单一缺氧模型中miR-21则表现为对PAH形成的促进作用[9]。这种矛盾可能一部分由于两种诱导方式之间的PAH严重程度和组织病理学变化的差异所导致：缺氧+SU5416 PAH模型的病理特征在于PAEC增殖加剧，其更接近地模拟人PAH[11，13]。然而在缺氧PAH模型中，对PAEC增殖影响较小，主要是PASMC增殖相对占优势，因此抑制miR-21可防止PASMC增殖和迁移，从而抑制PAH[15]。这些看似矛盾的结论可能由于miR-21在参与PAH发病机制的各种细胞类型中的作用不同。总之，miR-21在PAH中的作用是复杂的，有必要以空间和时间的方式进一步的研究充分阐明miR-21参与PAH的机制。

2）微小核糖核酸-143/145与PAH：miR-143和miR-145在一个多顺反子簇中有序排列，受共同的启动子区域调控，并被转录为一种共同的pri-miRNA[16]，因此常作为一组microRNA加以研究。miR-143/145簇位于小鼠18号染色体[17]或人类染色体5q33的1.7-kb高度保守区内[18]。由于miR-143/145在心脏，血管和内脏平滑肌细胞中表达最丰富，因此它被认为是为平滑肌细胞特异性miRNA。现已发现miR-145参与PAH的发病机制，研究证明暴露于缺氧条件下的野生型小鼠以及PAH患者中miR-145的表达均增加，此外还观察到miR-145基因敲除小鼠和用miR-145抑制剂处理后的小鼠对缺氧诱导的PAH发生有显着的保护作用[20]。

PASMC在各种条件诱导产生的生长因子刺激下细胞表型会从收缩型向增殖型转化，若组织中大量PASMC维持在增殖表型会导致血管增厚、管腔狭窄的发生。miR-143和miR-145的一些下游靶标已被鉴定，并且miR-143/145已被证明是维持平滑肌细胞收缩表型和功能所必需的[16，21]。例如在大鼠主动脉血管SMC中，miR-145通过抑制KLF5，导致心肌素的诱导激活和平滑肌细胞特征标记物例如α-SMA，钙调蛋白和平滑肌肌球蛋白重链的表达增加，维持细胞收缩表型[19]，Davis-Dusenbery及其同事还进一步发现，TGP-β和BMP4是通过分别诱导心肌素表达或心肌素相关转录因子（myocardin-related transcription factors，MRTFs）的核易位，使pri-miR-143/145转录增加生成更多的成熟miR-143/145，来抑制KLF4表达和增加收缩基因表达从而维持细胞收缩表型的[22-23]。Courboulin等[24]也发现了KLP-5在PAH模型中含量增加，并且抑制这种蛋白质在MCT诱导的大鼠PAH模型中能提供有益的作用。此外还有研究指出，具有II型骨形态发生蛋白受体（BMPR2）基因突变的PAH患者在重构的肺动脉和复杂病变（同心和丛状血管病变）中具有较高的miR-145水平，表明miR-145是BMP信令的下游目标并在PAH血管病变中起作用[19]。除了影响PASMC表型，Cheng等人在大鼠颈动脉球囊损伤模型中证明了miR-145与内膜新生有关，在损伤血管中使用携带腺病毒的miR-145恢复miR-145表达可降低新生内膜形成和KLP-5活化[19]。然而，Caruso在研究中还发现了缺氧处理单独原代PASMCs和PAECs后miR-145表达并无明显变化，这说明miR-145的表达在细胞水平和在体水平并不一致[20]。miR-145在PAH发生过程中在相应细胞中的功能及具体机制仍有待于深入研究。

3）微小核糖核酸-223与PAH：miRNA-223（miR-223）最初被描述为骨髓特异性miRNA，在骨髓谱系的细胞中可见高水平表达，粒细胞显示最高水平[25-26]，并作为几种肿瘤过程的生物学标志物[27-29]。有研究显示，它在神经保护中发挥重要作用[30]，并作为骨骼肌和心肌组织损伤的标志[25，31]。Caruso等[7]曾报道过慢性低氧处理的PAH大鼠肺中发现miR-223减少的现象。在对PASMC和PAEC生物行为影响的机制方面，Shi等[32]指出，血管内皮细胞中的miR-223通过靶向β1整合酶拮抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）介导的细胞增殖、迁移等过程从而抑制血管生成，是一种抗血管生成的miRNA。Meloche等人发现miR-223在PAH-PASMCs和野百合碱诱导的PAH大鼠的肺中表达出现下调，并且证明miR-223通过直接抑制PAH-PASMC中的PARP-140（一种DNA修复酶，细胞凋亡中核心成员半胱天冬酶的切割底物，在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥重要作用）起到抗增殖和促凋亡的作用[33]。近期，Yan等[34]在原代培养PASMC的和PAH大鼠模型体内中证实了RhoB是大鼠PASMC中miR-223的直接靶标，这一结果与先前报道的在人类细胞系中hsa-miR-223靶向结合RhoB的3′端的结果非常吻合[35]。同时还进一步证明了miR-223通过在转录后水平靶向调控RhoB和MLC2抑制PASMC增殖和迁移从而减轻缺氧引发的肺血管重构和PAH；mir-223表达激活剂使用后，由于缺氧引发的小、中型肺动脉中层膜增生以及在rPASMC和hPASMC中应力纤维组装等过程均显著减少，说明mir-223能拮抗体内缺氧引发的肺动脉压力升高和远端小动脉肌化[34]。尽管大多数证据证明了mir-223在拮抗血管重构中的积极作用，然而，Rangrez等[36]就发现在主动脉血管平滑肌细胞（vasacular smooth muscle cells，VSMCs）中过度表达miR-223有促进增殖并显着增强细胞迁移的作用。这些研究结果启示我们miR-223的功能可能存在组织特异性。最近，有研究发现了由heartrelated circRNA-miR223-ARC通路对于抗心肌肥大和心力衰竭的作用，这有可能为miR223与PAH的研究提供新的方向[37]。

2.微小核糖核酸与整合素β蛋白（integrin beta，ITGB）

整合素是一种由非共价连接的α亚基和β亚基组成的跨膜糖蛋白。最初被认为主要参与维持细胞粘附和组织完整性，然而进一步的研究表明，整合素还通过影响细胞活性、增殖、分化、迁移、形态、极性等方面参与炎症反应、免疫应答和肿瘤发生等过程[38-41]。整合素直接或功能性关联以下因子，激活下游信号传导途径来影响细胞行为：细胞内衔接子如p130Cas和Grb2；胞质酪氨酸激酶如Src家族（SRCfamily tyrosine kinase，SFK）和粘附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）；生长因子受体如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）；细胞因子受体如IL-3受体[42]。通过以上途径整联蛋白的信号传导可以“沟通内外”，通过与其配体结合后将细胞外信号转入胞内，影响肌动蛋白细胞骨架重排以及相关蛋白（包括细胞因子）的基因表达和转录以影响细胞过程。然而，计算预测表明，miRNA可以通过调节信号传导通路和功能的来实现对整联蛋白表达的调控。这在其他疾病的研究中已被大量证实，例如，miR-31的过度表达下调整合素α2，α5，αV和β3，并间接影响乳腺癌细胞中整合素β1的表达，从而抑制癌细胞侵袭并降低转移发生概率[43]。另外，据报道miR-29b可抑制肝星状细胞中胶原蛋白I和胶原蛋白II的表达，并降低整合素β1的表达[44]。此外，miR-29抑制肝星状细胞向肌成纤维细胞样细胞的转化，暗示miR-29可以作为靶向治疗肝纤维化的潜在靶点。除了下调胶原和整合素β1，在大鼠模型中也证明了miR-29出对盐敏感的高血压和肾损伤的保护作用[45]。miR-124在成胶质细胞瘤细胞系中的过度表达抑制了肿瘤的迁移和侵袭，伴随着整合素β1的表达下降[46]。一项研究报道，β3整合素降低VEGF受体2（VEGFR2）的表达，抑制VEGF/VEGFR诱导的血管生成和肿瘤生长，从而调节血管生成来影响肿瘤的生长[47]。Anita等提出了，PASMCs中的整合素与细胞外基质的相互作用有助于类似PAH等血管重构性疾病的进展[48]。在最近的研究中，Daile等证明了，通过整合素αvβ3/FAK/AKT通路破坏抑制骨保护素能减弱肺小鼠的动脉高血压形成[49]。根据这些研究，整合素有可能和PAH的许多病理过程产生联系。

3.结语

PAH的病理生理学是异质性和多因素的，使得未来治疗的进步和生物标志物的发现具有挑战性。药物治疗需要安全有效，理想情况下应该在疾病的早期阶段使用；然而，为了早期识别，需要使用更具体的生物标志物。miRNA的发现和功能特征大大增加了我们对细胞生物学的理解，并且它们无处不在的表达和对不同信号通路的影响使其成为细胞功能的中心调节器。一些表达水平与PAH严重程度相关的miRNA可用作PAH诊断和预后的生物标志物。此外，一些研究已经证明了肺和血浆miRNA水平之间的相关性，使得通过qPCR测量miRNA成为一种简单、无创和经济的诊断方式。miRNA表达的失调作为PAH发病机制中的关键事件已经得到证实，一些研究表明，通过模拟物或microRNA拮抗剂恢复miRNA表达，可以逆转不同动物模型中的PAH。因此，这些小规模的翻译调控因子为生物标记和治疗开辟了新的研究途径。然而，由于miRNA的结构，数量和变异性，miRNA qPCR的标准化仍然困难；关于作为潜在治疗的miRNA，没有任何基于PAH miRNA的治疗应用于临床。目前，涉及PAH的miRNA的研究数据呈指数增长，正如目前热门研究的参与PAH发展和右心衰竭的miRNA。将来，miRNA在靶组织中有效的、选择性递送技术也是至关重要的，这可能需要新的策略来调节基因传递系统，并通过使用合适的载体来转运选择性药物和核酸。