虹鳟伪雄鱼与正常二倍体群体血清类固醇激素含量的季节变化

谷伟，徐革锋，户国，黄天晴，张玉勇，白庆利，王炳谦

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

虹鳟Oncorhynchus mykiss是联合国粮食与农业组织优先推荐的世界性养殖鱼类。虹鳟全雌三倍体是不育品种，肉品质高、养殖周期长，是鲑鳟鱼产业的主导品种，我国年需卵量约3 000万粒[1]。伪雄鱼制备是虹鳟全雌三倍体规模化生产的关键技术之一。虹鳟雌鱼染色体型为XX，雄鱼为XY型。因此，只要使雌性配子（XX）与含有X染色体的精子（XX）受精，就能大量获得雌性后代，再通过静水压或水温控制即可获得全雌三倍体[2]。基于此目的，通过雌核发育技术获得全雌二倍体稚鱼，在鱼苗开始摄取外源性营养阶段通过给予雄性激素诱导获得性转换雄鱼（XX）。17ɑ-甲睾酮应用最为广泛，需控制好剂量，超量可致激素阉割[3,4]，目前已应用于生产实践[5-7]。

性类固醇激素的分泌水平与生长、配子发生和性腺成熟有关[8-11]，测定血清性类固醇激素可了解鱼类性腺发育水平，对生产安排有指导作用。硬骨鱼类的生殖过程受性类固醇激素睾酮（T）、11-酮基睾酮（11-KT）和雌二醇（E2）的调节，繁殖季节雌鱼T和E2、雄鱼T和11-KT随着配子形成而逐渐增加，性腺成熟之后显著下降[12]。E2在正常雄鱼的繁殖中必不可少[13]。目前，已研究了虹鳟、斜带石斑鱼Epinephelus coioides、西伯利亚鲟Acipenser baeri等多种鱼类性激素水平的年变化规律[14-16]，而虹鳟伪雄鱼尚未发现相关研究。

伪雄鱼培育周期长，输精管畸形，需要解剖鱼获取精巢使用。盲目剖鱼取精观察成熟度会导致培育成本大幅增加，造成浪费。本研究按季节测定了虹鳟伪雄鱼亲本血清类固醇激素水平，掌握性激素变化状况，以期为了解伪雄鱼生殖状态和合理安排生产提供基础技术资料。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

所选取样本为2013年3月和2014年3月通过17ɑ-甲睾酮（sigma公司）混合饲料投喂诱导的2批伪雄鱼（三、四龄鱼平均体质量为2 200 g和3 056 g），以同时期培育的正常二倍体群体为对照（三、四龄平均体质量为2 510g和3 600g），经过3年培育为亲本。亲鱼同池饲育，投喂鲑鳟亲鱼专用饲料（蛋白质42%，脂肪22%），日投喂量为体质量的1%～2%，日投喂2次。

1.2 组织切片

本研究选取3龄对照组与伪雄鱼，每组10尾。性腺样品采用Bouin’s液固定，常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。通过KD1508型切片机连续切片，厚度5 000～7 000nm，经H.E染色，中性树胶封片，用自动数码显微摄影系统拍照。

1.3 血清采集及性类固醇激素的测定

每2月采集一次血样，每次采集正常雌、雄鱼、伪雄鱼各10尾，每尾鱼血样单独进行测定。采样方法：样本鱼放入0.5 mL/L苯氧乙醇水溶液中麻醉2 min，尾静脉采血，每尾取血量不少于5 mL。血样在4℃冰箱中静置2h，然后3 000 r/min离心10 min，分离出血清注入采样管中，标明日期及性别（均有个体识别标记）。测试前血清保存在超低温冰箱中，全部样品集中测定性类固醇激素含量。采用DFM-96型16管放射免疫计数器测定血清中的雌二醇（E2）、睾酮（T）浓度，双管平行测定。碘[125I]睾酮放射免疫分析药盒和碘[125I]雌二醇放射免疫分析药盒由天津九鼎医学生物工程有限公司生产。

1.4 数据处理

实验数据用平均值±标准差（mean±SD）表示，经SAS软件进行方差分析。用DUNCAN对获得的数据进行多重比较分析，比较结果用字母标记法，在同一系列中相同字母表示差异不显著（P＞0.05），不同字母表示差异显著（P＜0.05），相间字母表示差异极显著（P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 伪雄鱼与正常二倍体雌雄鱼解剖学和组织学观察

解剖观察发现，对照组鱼精巢呈长条形，性腺饱满，为白色，血管丰富，输精管粗壮，精液可顺利排出。伪雄鱼精巢呈鹅卵石形，性腺饱满，为白色，血管丰富，输精管细狭并有结节，精液无法排出。图1为伪雄鱼与对照组鱼的性腺解剖学与组织学观察结果。从图1中可以看出，对照组鱼的精巢为一对，呈对称分布。伪雄鱼精巢两侧不对称，其中一侧或多或少地缺失一部分。比较发现，伪雄鱼精巢与对照组鱼精巢组织细胞结构并未有明显差异，且伪雄鱼的形态与卵巢相似。

2.2 三龄伪雄鱼与正常二倍体雌雄鱼血清中E2和T水平的比较

由图2可知，三龄伪雄鱼与对照组鱼T含量均在 12月份达到最高，伪雄（7.222±2.889）ng/mL，雄鱼 （13.944±3.709）ng/mL，雌鱼 （3.610±3.096）ng/mL，雄鱼T含量除6月份与雌鱼无显著差异外，其余月份均显著高于雌性亲本（P＜0.05）。伪雄鱼T含量4月份降到最低（0.088±0.015）ng/mL，随后逐渐升高；雄鱼和雌鱼T含量8月份降到最低，分别为（0.508±0.297）ng/mL和（0.274±0.027）ng/mL。图3为三龄伪雄鱼与对照鱼E2含量的周年变化。由图3可知，对照组雌鱼E2含量除12月份与伪雄鱼无显著差异外，其余一年中都显著高于雄鱼和伪雄鱼（P＜0.05）；对照组雄鱼和雌鱼E2含量10月到最高，分别为（82.658±5.777）pg/mL和（969.390±22.561）pg/mL，伪雄鱼E2含量则在12月份最高（185.735±29.978）pg/mL。

2.3 四龄伪雄鱼与正常二倍体雌雄鱼血清中E2和T水平的比较

由图4可知，四龄对照组雄鱼和雌鱼T含量均在12月份最高，分别为（12.080±5.834）ng/mL和（2.668±0.763）ng/mL，而伪雄鱼T含量则在翌年2月最高（6.109±2.153）ng/mL，8月最低（0.548±0.309）ng/mL，随后逐渐升高；雄鱼和雌鱼T含量分别在4月和2月降到最低，分别为（0.244±0.103）ng/mL和（0.051±0.008）ng/mL。图5为四龄伪雄鱼与对照组E2含量的周年变化。结果显示，对照组雌鱼E2含量除12月和2月份外，一年中都显著高于雄鱼和伪雄鱼；对照组雌鱼E2含量8月最高（1 068.867±64.561）pg/mL，对照组雄鱼E2含量10月最高（85.139±37.123）pg/mL，伪雄鱼含量 E2含量则在 12月最高（326.118±13.620）pg/mL，与雌鱼无显著差异，却显著高于雄鱼（P＜0.05）。

图1 伪雄鱼与发育正常二倍体雌雄鱼的性腺比较Fig.1 The gonadal morphology of male-induced and normal diploid male and female rainbow trout

图2 三龄伪雄鱼与对照组T周年变化Fig.2 The annual changes in serum T levels in 3 years old male-induced and control rainbow trout

图3 三龄伪雄鱼与对照组E2周年变化Fig.3 The annual changes in serum E2 levels in 3 years old male-induced and control rainbow trout

图4 四龄伪雄鱼与对照组T周年变化Fig.4 The annual changes in serum T levels in 4 years old male-induced and control rainbow trout

图5 四龄伪雄鱼与对照组E2周年变化Fig.5 The annual changesin serum E2 levels in 4 years old male-induced and control rainbow trout

3 讨论

性类固醇激素是一种脂溶性甾体激素，主要功能是调节促性腺激素合成与释放，维持鱼类性腺发育和排卵等生理活动[17]。本研究探讨了我国重要经济冷水性鱼类虹鳟伪雄鱼及二倍体血清性类固醇激素的表达变化规律和性腺特征等，为虹鳟伪雄鱼亲鱼的人工培育和产业化应用提供了重要技术依据。

3.1 虹鳟伪雄鱼性腺形态特征

有关虹鳟性腺发育模式、组织构造等研究已有大量报道[18,19]。本研究比较了伪雄鱼和正常二倍体雌、雄鱼的性腺组织及形态，发现伪雄鱼精巢呈鹅卵石形，输精管卡它性堵塞，要利用伪雄鱼需要提取性腺组织，而在组织切片中可以看出伪雄鱼精巢保持了雌鱼性腺的分化构造。伪雄鱼培育中，不能保证所有药饵均被鱼摄入，导致后代出现性腺未发育、性腺发育成正常雌鱼等[20]。所以，正确掌握伪雄鱼性腺形态，在生产中将起决定性作用。

3.2 性激素含量与性别和性腺发育的关系

性类固醇激素显著的影响鱼类的生殖过程[21,22],其分泌量可直接反映性腺发育状况，还可通过检测血浆性类固醇激素T的水平较早地鉴别鱼的雌雄[23]。本研究通过比较分析3龄和4龄虹鳟伪雄鱼、二倍体雄鱼及雌鱼性类固醇激素T和E2含量,结果显示三龄伪雄鱼与对照组血清T含量均在12月达到最高，伪雄鱼血清T含量4月份降到最低，随后逐渐升高，而雄鱼和雌鱼血清T含量8月降到最低。这也表明伪雄鱼和雄鱼T的变化同精巢的发育基本一致，证明了精子成熟须有较高水平的T才能完成[24]。三龄对照组雌鱼血清E2含量除12月与伪雄鱼无显著差异外，其余时间都显著高于雄鱼和伪雄鱼；对照组雄鱼和雌鱼血清E2含量10月最高，伪雄鱼血清E2含量则在12月最高。三龄伪雄鱼E2含量达峰时间显著晚于对照组鱼，这主要与其发育迟缓以及生理功能反转密切相关，伪雄鱼的性腺在从雌性向雄性反转的过程中要耗费很长时间使机体适应与生理相应，因此雌二醇达峰时间相对顺延了。4龄伪雄鱼和对照组雌雄鱼的E2含量峰值都是在它们的T含量达峰之前，这个规律一致，只是伪雄鱼E2和T的含量达峰时间较晚，这主要与其性腺生理结构改变有关。周年变化规律与对照组不一致，可能主要是与伪雄鱼的性腺生理机能退化有关，验证了E2在促进性细胞成熟中的重要生理功能，与谷伟等[14]对虹鳟选育群体性类固醇激素的研究结果相一致。据此，在繁殖季节12月利用3龄伪雄鱼最佳。

以往研究仅分析了初次产卵鱼，而未比较分析经产鱼。本研究显示，四龄对照组雄鱼和雌鱼血清T含量均在12月达到最高，而伪雄鱼血清T含量则在翌年2月最高，8月最低，随后逐渐升高；四龄对照组雌鱼血清E2含量除12月和2月外，一年任何时间都显著高于雄鱼和伪雄鱼。伪雄鱼血清E2含量则在 12月达最高（326.118±13.620）pg/mL，与雌鱼无显著差异，却显著高于雄鱼（P＜0.05）。Fostier等[12]认为，雌雄亲鱼血清中T含量，是因为硬骨鱼能合成T，而T可以转变成E2。本研究中雌鱼血清中T含量很高，与林浩然等[25]认为T是雌激素的前体一致。伪雄鱼的E2显著高于雄鱼，认为这可能是在伪雄鱼培育过程中，未完全抑制雌激素导致。本研究中，伪雄鱼血清T含量最高点出现在翌年2月份，与生产中的情况一致，这更加证实了性类固醇激素分泌量可直接反映性腺发育状况。因此，在繁殖季节4龄伪雄鱼的最佳利用时间是在翌年2月份。

本研究发现，虹鳟伪雄鱼的性类固醇激素周年变化规律在4龄之前与对照组基本一致，但随着时间推移，伪雄鱼的性腺机能显著退化，其性类固醇激素含量波动很大，没有规律性，但由于遗传及环境的作用，在生殖季节还是能产生繁殖生理反应，这些结果可作为虹鳟正常二倍体和伪雄鱼亲鱼性腺发育成熟、有效利用的重要参考。