自噬在急性胰腺炎中作用机制的研究进展

张 玲，张海丹，赵 婧，肖丹阳，李培武

(兰州大学第二医院急诊科,兰州730030)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是指多种病因导致胰蛋白酶原激活，继以胰腺局部炎症性反应为主要特征、可伴有全身炎症反应综合征和(或)多脏器功能衰竭等严重并发症的自身消化性疾病，其起病急、病情重、并发症多。近年来，AP的发病率呈上升趋势，总体病死率为5%～10%[1]。经多年研究，胰蛋白酶原的病理性激活和随后的胰腺组织自我消化性损伤已成为对AP的认识基础[2-3]。研究发现，胰蛋白酶原的异常激活及其酶原颗粒的形态学变化与自噬活性有关[4]。同时，研究显示自噬受损是AP中突出的病理事件，与胰酶的异常激活密切相关[5]。此外，腺泡细胞中自噬溶酶体大量积累，表现为溶酶体标志物微管相关轻链蛋白3(light chain 3 protein，LC3)和p62水平增加[6]。此时，因受损的线粒体清除障碍、氧化应激以及核因子κB途径的激活，导致大量活性氧类积累，进一步加重胰腺损伤[7]。相反，Wan等[8]研究显示，自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤)抑制或纠正细胞异常自噬后能显著降低胰酶活性、组织损伤的严重程度以及细胞因子水平，并能改善预后。总之，生理性自噬或高效自噬可能保护或减轻胰腺组织免受应激性损伤，而异常自噬可引起胰蛋白酶原异常活化、促进胰腺的级联反应。现就自噬在AP中作用机制的研究进展予以综述。

1 自噬概述

1962年Ashford和Porter[9]在肝细胞中首次发现细胞自噬。它是一种将细胞内受损的细胞器和大分子物质运送至溶酶体进行降解的细胞“清除”过程，是细胞对外来刺激做出的防御反应，受自噬相关基因(autophagy-related gene，Atg) 的介导，受生长因子、营养素、能量供应、细胞因子和感染等多种自噬信号的调节[10]。根据降解物的不同，自噬执行不同的功能，包括质量控制(线粒体自噬)，病原体清除(虫噬)和能量供应/代谢控制(脂噬)[11]。自噬发生有四大关键步骤：自噬的诱导；自噬小体的形成；自噬溶酶体的形成；内容物的降解。以上四步缺一不可。在大多数细胞中，自噬是一种重要的保护机制，能使细胞存活并适应环境条件的改变。生理条件下，细胞内出现双层膜结构并包裹多余的蛋白质和细胞器形成自噬小体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将内容物降解为氨基酸和非酯化脂肪酸供细胞再利用[12]。当细胞发生感染等各类应激时，损伤相关分子模式和病原体相关分子模式通过Toll样受体4或Toll样受体9激活核因子κB、促分裂原活化的蛋白激酶等信号通路直接调控自噬相关蛋白的表达，或通过蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路诱导自噬的激活，从而执行其降解及清除功能[13]。总之，自噬通过更新细胞内老化物质以维持细胞稳态，是一种重要的细胞活动。

1.1自噬分类 根据与溶酶体的作用关系，自噬可分为巨自噬、分子伴侣介导的自噬和微自噬[14]。其中巨自噬是真核细胞主要的降解途径，既能缓解细胞应激反应又能提供细胞生物发生的基本物质，故通常称为自噬[15]。根据降解底物的不同可分为选择性自噬和非选择性自噬，其中自噬主要是指非选择性降解系统[16]；分子伴侣介导的自噬通过热激蛋白70调控一种选择性降解系统；而微自噬兼选择性和非选择性降解功能[17]。

1.2自噬蛋白 诱导自噬的4大关键步骤是相继发生的，其中自噬诱导至自噬小体形成过程中涉及自噬标记蛋白的产生，目前最常用的有LC3(主要指LC3Ⅱ或LC3Ⅱ/Ⅰ比值)和Beclin-1，在自噬体膜的形成和延伸中起关键作用[6，18]。此外，自噬小体本身又被用于监测自噬活性。

1.2.1LC3 LC3是与细胞微管的功能部位紧密结合的可溶性胞质蛋白，有两种存在形式，即LC3-Ⅰ(胞质型)和LC3-Ⅱ(膜结合型)，其中LC3-Ⅰ由LC3前体裂解而来，并进一步转化成LC3-Ⅱ，成为自噬小体膜结合蛋白[19-20]。研究显示，在自噬信号作用下，LC3-Ⅰ通过与Atg7、Atg3、Atg10和Atg12-5-16L泛素样系统的结合作用，与磷脂酰乙醇胺偶联形成LC3-Ⅱ，然后被募集到分离膜上参与自噬过程[21]。据报道，LC3-Ⅱ是第一个发现的与自噬体膜特异性结合的哺乳动物类蛋白，参与自噬体对蛋白的靶向识别和包裹，起到自噬膜的形成、延伸以及闭合作用，通常用来监测自噬[18]。Wu等[21]研究显示大鼠LC3与酵母Apg8/Aut7 /Cvt5(Atg8)具有28%的氨基酸同源性，这也是酵母发生自噬的关键因素。LC3存在于自噬体内、外膜上，对于自噬体的成熟必不可少，是监测自噬活性的主要指标之一[22]。

而哺乳动物Beclin-1是酵母Atg6和液泡分选蛋白30基因的同源物，主要存在于反面高尔基体、内质网与线粒体膜上，在自噬小体膜形成的早期阶段起至关重要的作用，也是用来监测细胞自噬的主要蛋白[23]。

1.2.2自噬小体在各类应激诱导自噬发生期间，胞质中首先出现囊状双层分隔膜(主要包含质膜、内质网、线粒体等)在异常物质(异常蛋白质、受损细胞器及病原体)周围形成、延伸，并将其隔离并包裹形成双层膜结构的自噬小体[24]。随后自噬小体将内容物运送至溶酶体，通过与内涵体的融合经历自噬体成熟过程后再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，执行降解功能[25]。需要注意的是，自噬小体本身不具备降解功能，只有与溶酶体融合形成自噬溶酶体后才能降解并清除异常物质。

2 自噬与AP的关系

自噬过程广泛存在于生物体内，且高度复杂，在各类应激状态下其作用更为显著。自噬可能是各种应激因素引起AP的最后共同通路之一[26-27]。研究显示，胰腺腺泡细胞内的自噬空泡或自噬小体含有胰蛋白酶原颗粒，是AP早期的主要病理学特征，并与AP预后密切相关。关于人类AP的早期报道中就提到了腺泡细胞具有自噬特征的超微结构[28]。Yu等[29]在大鼠AP中也观察到腺泡中囊泡结构表现出典型的自噬样形态。据报道，生理性自噬并不触发AP的病理性进展[30]，此外，自噬溶酶体还可以清除异常激活的胰蛋白酶，从而保护胰腺组织损伤[4]。这一结果与理论意义上自噬作为一种细胞清除过程、执行异常物质的降解功能是相符的。因此，正常或生理性自噬不会加重AP的病理性损伤，而是通过发挥其本质作用以清除胰腺腺泡细胞内的异常蛋白质和受损细胞器(尤其是线粒体)，减轻胰腺腺泡细胞的各类应激性损伤，同时还有助于维持胰腺的外分泌功能[31]。然而，当自噬功能失代偿后，便出现异常自噬，此时，自噬反而加重AP的病理性损伤，增加AP病死率。

2.1异常自噬加重AP的病理性损伤 Mareninova等[6]研究表明胰蛋白酶原过早激活与胞质空泡的异常积累是AP的两个关键表现。Resau等[32]在1985年提出AP胰腺实质的变化包括内质网扩张、高尔基复合体囊泡形成和自噬空泡的异常堆积。Diakopoulos等[33]通过敲除Atg5基因构建自噬受损小鼠模型，发现自噬在胰腺的稳态中发挥重要作用，同时发现异常自噬是引起AP病理损伤的关键点。此外，Liu等[34]通过精氨酸诱导大鼠AP模型发现，胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原的活化可能与自噬通量受损有关，表明自噬受损可引起AP严重的病理反应、加重胰腺的自身消化性损伤。Yang等[7]研究表明，腺泡细胞中自噬小体的异常聚集是导致急性坏死性胰腺炎的关键病理反应。同时，有研究特别表明自噬通量受损不仅介导胞质空泡化，还介导胰腺的特征性反应，即腺泡内胰蛋白酶活性增加，表明异常自噬有助于胰蛋白酶原的活化[16]。Lewinska等[35]、Wang等[36]在急性坏死性胰腺炎大鼠中发现自噬受损还与细胞凋亡密切相关，并将加重疾病的严重程度。

2.2自噬与胰蛋白酶原的活化 生理条件下，胰蛋白酶以非活性形式储存于膜限制性的酶原颗粒中，到达十二指肠经肠肽酶激活并相继活化其他消化酶。胰蛋白酶原的病理性激活是AP的主要机制。研究已证实了AP时胰蛋白酶原的腺泡细胞内激活机制[34]。AP期间出现自噬通量受损，引起自噬小体在胞质内大量堆积，此时自噬小体将胰蛋白酶原运送至溶酶体中被活化成有活性的胰蛋白酶，从而对腺泡细胞产生破坏性作用，表明AP时胰蛋白酶原的异常活化与自噬通量受损密切相关[37]。此外，Ohmuraya和Yamamura[38]研究发现通过特异性敲除Atg5解除或纠正大鼠AP时的异常自噬后，胰腺组织的病理性损伤明显减轻，同时胰蛋白酶原的活化程度被大大抑制，表明异常自噬参与胰蛋白酶原的活化。这一研究结果也得到了Hashimoto等[16]的证实。

另外，Dolai等[39]研究发现Syntaxin 2(即STX2，一种突触融合蛋白，介导腺泡细胞顶端质膜与酶原颗粒复合物参与的顶端胞吐作用[40])的缺失通过某种机制导致胰蛋白酶原被异位释放而过早激活，引起胰腺自我消化性损伤，最终触发AP。同时，Ravikumar等[41]研究表明STX2的缺失通过增强自噬相关蛋白16样1/网格蛋白重链-1复合物介导的质膜基底外侧胞吐作用而引起异常自噬。由此推测，STX2在异常自噬与胰蛋白酶原的异常活化过程中具有潜在作用。

异常自噬引起胰蛋白酶原的活化机制至少有两种途径：溶酶体组织蛋白水解酶的失调；溶酶体相关膜蛋白的异常表达。Gukovsky等[42]研究表明，AP期间出现异常自噬的主要原因可能与溶酶体活性的改变有关，主要表现为组织蛋白酶加工损伤和成熟的组织蛋白酶数量减少。研究表明，在胰蛋白酶原的活化过程中组织蛋白水解酶L和组织蛋白水解酶B起到完全相反的作用，即前者可以使胰蛋白酶原和胰蛋白酶失去活性[43]，而后者有助于胰蛋白酶原向胰蛋白酶的活化[16]。Dennemarker等[44]通过敲除组织蛋白水解酶L基因后发现小鼠体内自噬对胰蛋白酶原的降解水平显著降低。当自噬受损后，成熟的组织蛋白水解酶L和组织蛋白水解酶B数量明显减少、活性下降，且前者较后者下降更为显著，比例失调，导致前者无法拮抗后者的作用，引起溶酶体中胰蛋白酶增多，自噬空泡数量异常堆积，触发AP的病理性损伤[6]。Halangk等[45]通过敲除小鼠组织蛋白水解酶B基因，发现小鼠体内胰蛋白酶活性明显降低，同时胰腺腺泡细胞的坏死量减少、组织坏死程度明显减轻。胰蛋白酶原的过早或异常激活是AP发生的主要病理基础，提示AP期间细胞自噬功能受损是导致胰蛋白酶原异常活化、胰腺组织发生进一步损伤的可能原因。

2.3自噬与炎症放大反应 AP的病理特征之一是胰腺腺泡细胞释放大量细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-2、白细胞介素-12、γ干扰素[46]等，其作用于Toll样受体或启动核苷酸结合寡聚化结构域蛋白信号通路，使核因子κB活化，进一步产生大量炎症介质，引起组织炎性浸润，导致局部或全身爆发性炎症反应，最终加重胰腺细胞坏死[47]。一般地，自噬作为一种细胞防御反应，经各类应激的刺激和诱导参与各种病理生理反应，其中自噬在感染与炎症及免疫系统中的调节作用尤为显著，通过形成自噬溶酶体降解并清除炎性小体等异常物质，减轻组织的炎性损伤。然而，当自噬功能受损后，其清除能力被大大削弱，导致炎症介质的清除率显著降低，炎性小体过度堆积加重组织损伤[48]。自噬受损时p62得不到及时的降解，从而引起核因子κB的过度活化，释放大量炎症因子，其中肿瘤坏死因子-α又进一步诱导胰蛋白酶原激活，加重胰腺损伤。可见，AP期间细胞自噬功能受损对胰腺细胞的损伤是双重的。

3 小 结

AP是一类病因复杂的疾病，触发AP的一个中心机制是胰蛋白酶原的异常激活。正常或基础水平的高效自噬主要通过自噬溶酶体执行清除及降解细胞内的大分子物质。而当细胞自噬异常时，不仅诱导胰蛋白酶原的异常活化，还使AP期间的炎症反应被逐一放大。近年来，虽然关于自噬对AP作用机制的研究已取得一定进展，但自噬功能受损与AP之间的因果关系尚未阐明。同时自噬作为一种细胞活动，是动态过程，在AP期间的自噬动力学尚不清楚。因此，自噬功能受损出现在AP哪个阶段，以及出现自噬异常的具体机制有待进一步探索。此外，还需大量实验研究揭示异常自噬被解除或纠正后的自噬状态对胰腺细胞的影响以及AP时异常自噬的分子生物学机制。目前AP的治疗还止步于液体复苏、抗感染、对症支持等综合治疗，而自噬这一概念的提出将为未来实现AP的特异性治疗提供新的理论依据，同时，这对目前AP的对症治疗理念也是一种新挑战。