外泌体与子代神经精神疾病诊治的研究进展

杨燕平，常清贤

(南方医科大学南方医院妇产科，广州 510515)

产前多种不良因素可引起胎儿大脑神经发育异常，从而增加子代神经精神疾病的发病风险[1]。子代神经精神疾病潜伏期长，通常在发病的数年后诊断，缺乏客观和敏感的早期诊断指标[2]。因此，如何在临床症状出现前早期诊断、干预和治疗至关重要。外泌体是一种具有脂质双层结构的纳米级细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，直径为40～120 nm。20世纪80年代，外泌体首先在网织红细胞中被发现，后被命名为“exosome”,随后发现神经细胞、间充质干细胞等多种类型的细胞均可分泌外泌体到细胞外环境。外泌体内含蛋白质、脂质以及RNAs等多种活性分子，介导体内不同类型细胞间的通讯，从而影响机体生理和病理状态[3]。作为一种新型的细胞间通讯方式，外泌体可靶向运输特异性蛋白质及微RNAs(microRNAs,miRNAs)等遗传物质，参与胚胎神经发育及神经精神疾病如自闭症、精神分裂症等的病理生理过程[4-5]，发挥调控基因转录、表达、传递信息载体的作用，是近年来研究的热点。外泌体广泛存在于血液、母乳、尿液、羊水、腹水、脑脊液等生物体液中[6-7]。研究表明，胎儿神经源性外泌体在妊娠早期约6周即可在母体外周血循环中检测到，其是一种非侵入性的早期诊断和评估胎儿神经发育及脑损伤的方法[2,8]，可能是潜在的生物标志物，具有广阔的临床应用前景，可为疾病的预防、早期诊断以及靶向治疗提供新思路。现就外泌体与胚胎神经发育及子代神经精神疾病的关系的研究进展予以综述。

1 外泌体概述

1.1外泌体的形成和释放 外泌体主要通过内吞体分选转运复合体途径由细胞多泡体(multivesicular body,MVB)内出芽形成[6]。外泌体胞膜由鞘磷脂、胆固醇、富含神经酰胺的脂筏等组成，形态规则，大小相对一致，电镜下呈杯状半透明结构[3]。MVB可分为分泌型和降解型两种。在分泌型MVB中，4种蛋白复合体及辅助蛋白共同参与形成MVB，然后与细胞膜融合向细胞外环境释放外泌体。在降解型MVB中，内体囊泡与内体腔膜融合，随后与溶酶体融合降解形成外泌体。目前尚无能够识别分泌型MVB和降解型MVB的蛋白标志物。此外，可能还存在其他非依赖内吞体分选转运复合体的途径，包括神经酰胺、热激蛋白等。外泌体的形成和释放受多种因素的影响，如GTP酶、MVB锚定机制、Rab家族因子等[9-10]。

1.2外泌体的内容物及特点 外泌体包含蛋白质、脂质以及miRNAs等多种活性内容物,可以靶向传递活性内容物给目标细胞或器官，发挥调节基因转录、表达等作用，实现细胞间遗传物质的交换[10]，但具体机制尚不明确。外泌体的双层脂质膜可以保护携带的活性内容物在细胞释放后避免体内通路和RNA酶的降解，同时逃避免疫系统的影响，因此外泌体有良好的循环稳定性，且易通过血脑屏障、血脑脊液屏障、胎盘屏障等生物屏障[11-14]。

1.3外泌体在神经细胞通讯中的作用 外泌体在神经细胞间的通讯中发挥着重要作用，如在神经元与神经元、神经胶质细胞与神经元之间传递信号，促进神经轴突再生，增加神经元活性，维持神经系统结构和功能的完整性；神经元去极化后分泌的外泌体在突触间选择性修剪非活性突触，调节神经突触的可塑性[13]；促进神经元分化，缺氧和饥饿状态下的神经胶质细胞来源的外泌体具有神经保护作用[5]。

2 外泌体与胚胎神经发育

外泌体在神经细胞间传递信息，与神经发育及功能密切相关[4]。几乎所有的神经细胞都能释放出miRNAs，其中大部分被包裹在EVs,包括外泌体中，并能在生物液体中检测到[2,8,12]。妊娠6周时就可以在孕妇循环中检测到胎盘源性外泌体，是非妊娠女性的50倍[15]。外泌体在母胎通讯交流过程中维持胎盘稳态[16]，参与胎儿神经发育[8]、妊娠相关疾病[15]及自闭症等[13]的多种生理及病理过程。

2005年首次在小鼠胚胎脑发育过程中发现神经管腔外泌体的存在[17]，随后发现，神经胶质细胞衍生的外泌体可促进神经细胞的生长和存活。Feliciano等[18]研究表明，人类胚胎神经干细胞源性外泌体携带特异性miRNAs和蛋白质，可激活胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通路，促进神经干细胞扩增。神经源性外泌体在神经细胞间传递信号，对神经发育的影响主要取决于内容物。脑组织中富含miRNAs，其在转录后水平负调控基因的表达，对脑神经发育和分化过程以及神经细胞功能起关键作用[8,19]。

Moreau等[20]通过RNA测序技术对胎儿、产后早期以及成人的脑组织进行检测发现了人类大脑发育过程中不同miRNAs的时间表达谱。研究显示，miRNAs在胎儿、早期出生后以及成年脑组织中的表达特征显著不同，大脑发育相关的特异性miRNAs如miR-124和miR-9在胚胎神经发育早期表达上调，而部分miRNAs在出生后表达下调。与自闭症、精神分裂症以及抑郁症等相关的基因组中，差异表达的miRNAs靶点高度富集[21]。进一步研究显示，孕妇妊娠期在不利的环境因素或紧张经历作用下可通过改变表观遗传调控机制如miRNAs的表达、DNA甲基化以及组蛋白修饰，影响胎儿的内分泌机制和大脑发育过程，增加子代神经和精神疾病的发生风险[2]。除miRNAs外，外泌体也含有丰富的蛋白质，如热激蛋白、四次跨膜蛋白，参与细胞间通讯[7]。在整个发育过程中，基因表达受到一系列进化保守蛋白如Notch、Wnt、转化生长因子-β等的调控[6]。

3 外泌体在神经精神疾病中的诊断作用

3.1自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD) ASD是目前最热门的研究领域之一，是以持续的社会缺陷和有限重复的行为模式为核心症状的一组神经发育障碍[4]。Goetzl等[8]研究显示，可从孕妇血浆中分离提纯出胎儿神经源性外泌体，胎儿神经源性外泌体的相对比例、绝对数量及神经细胞类型随妊娠期阶段的改变而改变，而在非妊娠期孕妇的血浆中无法检测到，提示胎儿神经源性外泌体可作为妊娠早期无创评估不良因素宫内暴露，造成胎儿神经发育障碍的一种强有力的工具，最终降低子代ASD的发生率。ASD患者组织或血清中miRNAs的水平会发生改变[22]，而循环中的miRNAs非常稳定，可作为一种非侵入性的诊断标志物[23]。另一研究显示，ASD患者血清中差异表达的miRNAs(如hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-328)预测靶基因富集于ASD相关的神经通路，提示hsa-miR-181b-5p等miRNAs可能是ASD相关的潜在的早期诊断生物标志物[4]。综上，检测孕妇循环中胎儿神经源性外泌体或差异表达的特异性miRNAs可作为早期诊断宫内胎儿神经发育情况及评估ASD发病风险的无创性方法之一。但目前缺乏关于miRNAs参与ASD的直接证据，尚需进一步研究明确相关的特异性外泌体源性miRNAs[22]。

3.2精神分裂症 精神分裂症是一种严重的精神障碍，以妄想、幻觉等行为异常、运动能力受损及认知缺陷为特征，影响着全世界1%的人群，发病率和死亡率逐年升高[24]。一项荟萃分析显示，产科并发症如妊娠期糖尿病、先兆子痫等可增加胎儿出生后精神分裂症的风险[25]。在精神分裂症患者中，特异性外泌体源性miRNAs(miR-497)差异表达显著增加[24]。此外，循环中的miRNAs参与了精神分裂症的病理过程，并可作为循环生物标志物[26-27]。在一项涉及330例精神分裂症患者和202例健康者的荟萃分析中，精神分裂症患者外周血单核细胞中差异表达的miRNAs(如miR-181b-5p等)诊断精神分裂症的敏感性和特异性均较高，提示可作为诊断精神分裂症的生物标志物[27]。目前外泌体源性miRNAs与精神分裂症之间的具体关系还不明确，即外泌体源性miRNAs的变化是精神分裂症发病机制的一部分，还是一种适应性代偿改变，尚需行进一步的大样本研究证实。

3.3其他神经系统疾病 阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，是以记忆力减退和认知能力下降为特点的复杂疾病。血液中神经源性外泌体中Tau蛋白(如P-S396-tau)的水平变化可在临床发病前早期预测AD的发生[28]。研究表明，体液中神经外泌体源性miRNAs已成为解决AD患者早期诊断困难的有力工具[13,29]。此外，在神经系统肿瘤方面，肿瘤相关的特异性miRNAs、长链非编码RNAs等可作为新型生物标志物，前景良好。外泌体可从癌症患者的血清或脑脊液中分离出来，其中神经肿瘤来源的外泌体 miRNAs 的表达水平与肿瘤的诊断具有显著的相关性[30]。相比传统的影像学或病理学方法，生物体液来源的神经肿瘤外泌体及其携带的内容物(特异性miRNAs等)是一种快速、低侵入性、可靠的生物标志物。以上方法均起到液体活检的作用，可减少或避免外科手术、脑组织活检等侵入性检查[30]。

4 外泌体在神经精神疾病治疗中的作用

4.1潜在的治疗靶点 AD的主要病理特征是病理性Tau蛋白的积累，在疾病早期Tau蛋白从内嗅皮质传播到海马区。小胶质细胞是大脑中主要的吞噬细胞，与病理性Tau蛋白的传播累积过程具有相关性，但它们是如何参与Tau蛋白传播的尚不清楚。Asai等[31]的研究显示，在AD中小胶质细胞通过外泌体分泌传播Tau蛋白，并且抑制外泌体的合成可显著减少蛋白Tau在体内外的繁殖传播，表明外泌体分泌途径可能是治疗AD的靶点。体外实验显示，人类脂肪细胞中的间充质基质细胞可分泌含有功能性脑啡肽酶的外泌体，降解已分泌的和细胞内的β淀粉样蛋白[32]。研究发现，将载有针对AD治疗靶点BACE1(编码β分泌酶1)的内源性小干扰RNAs的外泌体注入野生型小鼠中，可观察到BACE1明显下调，这表明外泌体可作为治疗AD的一种新途径[32]。改变大脑中特定的miRNAs的水平可改变行为[23]，如输注含有小干扰RNA的外泌体可使亨廷顿患者35%的miRNAs沉默表达，从而使其行为表现改变。此外，基于外泌体的肿瘤免疫疗法有望将外泌体作为“疫苗”用于预防传染性疾病或胎儿疾病的宫内治疗[23]，但目前还缺乏临床实验数据。

4.2新型药物传送载体 纳米技术的发展为疾病的诊治提供了新方法。与传统合成的纳米输送系统相比，外泌体循环稳定、免疫原性低、生物相容性和生物屏障通透性好[11]。来自成人干细胞的外泌体有望成为向大脑输送治疗药物，从而治疗脑部疾病的一种新策略。间充质基质细胞是一种可以从多种组织中分离出来进行细胞培养的具有自我更新能力的多能祖细胞，在不同因素作用下可产生大量具有不同特征的外泌体[33]。外泌体可在细胞间穿梭输送RNAs，并在受体细胞中翻译，产生特定的蛋白质，提供重要信号，进而调节受体细胞的功能[10]。间充质干细胞或生物工程组装的外泌体可作为肿瘤药物治疗的载体[11]，可降低致瘤风险，发挥抗癌或抑制化疗耐药的作用，可作为下一代新型药物输送系统的候选载体[34]。作为新型的基因传递载体，外泌体为疾病的基因治疗提供了新途径[35]。外泌体有独特的优势，既可通过多种生物屏障，又能发挥多种细胞间遗传通信，可发生在微环境中，也可发生在远处，即外泌体以类似激素的方式在体循环中输送通讯信号进而影响受体细胞的功能。外泌体能够远距离将核酸传递给细胞的能力也使其成为基因治疗的理想载体，有望成为用于靶向治疗胎儿发育异常及相关疾病的一种新型的内源性天然药物载体，从而减少药物对母体造成的不良影响。目前也存在一些问题，如缺乏统一的外泌体分离和量化方法、潜在的不良反应，未来需进一步大样本临床研究去验证[34]。

4.3监控病情状态或进展 生物体液中的外泌体携带着特异性活性物质，可作为监测神经疾病状态的一种有效手段。研究表明，AD患者外泌体中的磷酸化Tau和β淀粉样蛋白1-42水平的升高可帮助监测AD患者的疾病状态[28]。另一项研究通过分析ASD与健康者尿液中的微生物群及其外泌体发现，与健康对照组相比，ASD组中微生物群的分布发生了显著变化，提示ASD患者尿液中细菌来源的外泌体可作为快速评估ASD患者微生物群改变以及监测ASD患者行为的有效工具[36]。胎儿DNA可穿过胎盘在妊娠早期母体的循环血中被提取分离出来，从母体血浆中分离纯化的特异性的胎儿神经源性外泌体可作为妊娠早期监测胎儿神经发育的一种有效指标。此外，中枢神经系统肿瘤相关特异性外泌体可用于监测癌症进展或新出现的耐药细胞，为疾病的精准预测、治疗和干预提供新途径[31]。但目前外泌体尚处于初步研究阶段，有待进一步临床验证。

4.4再生医学的应用 目前干细胞治疗已经成为改善心肌梗死后心脏重塑的一种潜在方法。胎儿和围生期心脏干细胞或小儿心脏祖细胞来源的外泌体具有取材容易、自我更新强以及无瘤性的特性，具有促进心肌再生、修复以及改善心脏功能的作用[37-38]。CD34+细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞等多种类型细胞来源的外泌体可通过旁分泌或其他潜在机制减少血管纤维化、促进血管修复，进而改善心肌功能。目前关于胎儿神经系统再生的研究相对较少，且主要基于体外实验。胚胎、脐带等多种来源的间充质干细胞外泌体具备多向分化、免疫排斥小、致瘤风险小等优点，可用于神经组织的再生修复[39]。对脑卒中动物模型的研究显示，间充质干细胞衍生的外泌体可诱导神经功能恢复和神经血管重塑，促进神经再生，为干细胞治疗疾病提供新思路[40]。

5 小 结

外泌体作为一种新的细胞间通讯方式和载体，在胚胎神经发育和子代神经精神疾病的诊治中发挥着重要作用。目前大部分研究基于体外试验，且部分研究结果不一致，因而需要大样本的体内和体外实验去验证[11,34-35]。外泌体具有广阔的临床应用前景，现代技术的发展及研究的深入将为解决临床问题提供新的思路和依据。未来的研究方向可能包括：①利用生物信息分析学或下一代基因测序技术等从分子或基因水平探讨外泌体与母胎疾病发病机制的关系；②探索外泌体相关的母胎疾病治疗新靶点及新型药物载体以研发新药物；③寻找特异性的外泌体生物标志物用于疾病的早期诊断或病情监测；④基于外泌体的再生医学或宫内基因治疗，治疗胎儿或婴儿某些先天神经发育缺陷或畸形，进行精准治疗和个性化治疗。