自噬在脓毒血症中的作用研究进展

吴 泽，付 斌，符策岗

(1.中南大学湘雅医学院附属海口医院 海口市人民医院急诊科，海口 570208；2.上海市第六人民医院 海口市骨科与糖尿病医院骨科，海口 570300)

脓毒血症是一种可以导致严重多器官功能障碍综合征的致死性临床疾病。虽然关于其治疗在抗生素治疗、呼吸机管理、复苏策略和血糖维持等方面取得了一定进展，但严重脓毒血症仍是重症监护病房的主要死亡原因[1]。在抗生素时期，脓毒血症被定义为病原体引起的全身炎症反应综合征。然而，近年来脓毒血症被定义为由宿主对感染反应失调引起的威胁生命的器官功能障碍[2]。据调查，多器官功能障碍在脓毒血症患者并发症中占40%～60%[3]，传统的抗感染治疗和支持治疗旨在改善脓毒血症诱导衰竭器官的功能，但治疗效果不佳[4]。以往研究认为，脓毒血症引起的组织器官损害可归因于炎症反应的过度活化[5]、免疫功能紊乱[6]和凝血功能障碍等[7]。在脓毒血症诱导的多器官功能障碍中可伴有自噬的改变，并对疾病产生一定的影响。在脂多糖或盲肠结扎穿刺术诱导的脓毒血症中，自噬发挥着双重作用，其在早期促进细胞和组织的生存，晚期发挥损伤作用。现就自噬在脓毒血症中的作用研究进展予以综述。

1 细胞自噬概述

自噬通常可分为选择性自噬和非选择性自噬。非选择性自噬是一种进化上保守的细胞质降解系统，其内的各种物质被双膜结构-自噬体隔离，随后运送至溶酶体进行降解，以维持细胞稳态。但非选择性自噬需要受体蛋白识别后才能降解各种物质，如通过线粒体自噬方式回收损伤或功能不全的线粒体。在饥饿、活性氧类聚集及各种微生物等刺激下，自噬水平的失衡容易导致细胞器的破坏，能量代谢紊乱，最终引起细胞死亡和凋亡[8-9]。目前，酵母的遗传学研究已鉴定出30多个自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)，在自噬过程中，Atg以高度调节的方式按顺序连接。这些Atg可组成包括Atg1/unc-51样激酶起始复合物、Ⅲ类磷脂酰肌醇激酶成核复合物、磷脂酰肌醇-3-激酶结合Atg18/Atg2复合物、Atg5-Atg12偶联体系和Atg8/微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain,LC3)-磷脂酰乙醇胺偶联体系在内的5种官能团，它们参与自噬体的启动、形成、伸长和融合[10]。自噬始动于Atg1/unc-51样激酶复合物的活化与分离膜。然后，通过活化Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶复合物、Atg14和Beclin-1等形成双层膜结构-隔离膜。在哺乳动物中，分离膜主要起源于内质网-线粒体接触部位，也可起源于包括高尔基体、内质体和质膜在内的其他部位。Atg5-Atg12复合物与Atg16结合可将分离膜扩展为自噬体膜，随后LC3和γ-氨基丁酸受体相关蛋白家族成员与磷脂酰乙醇胺结合并募集到膜中。Atg4B和Atg7，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺结合促进LC3-Ⅱ形成，这种脂类共轭形式的LC3通常用作自噬体标志物。最终，自噬体与溶酶体融合，内容物降解，有用成分被回收或用于代谢途径[10-11]。

2 自噬与脓毒血症

脓毒血症诱导的自噬是通过微生物结构中的病原体相关分子模式与模式识别受体结合开始，常见的模式识别受体包括Ca2+依赖型糖结合跨膜分子、视黄酸诱导基因1[12]和Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)等，这种结合反过来又可以激活不同的细胞内事件，并促进LC3-Ⅰ向LC-Ⅱ转化，从而导致自噬活性的增加。研究表明，革兰阴性菌的脂多糖与TLR4结合后通过促分裂原活化的蛋白激酶/p38信号通路激活自噬[13]。而磷脂壁酸与TLR2结合后通过促分裂原活化的蛋白激酶1/胞外信号调节激酶2-促分裂原活化的蛋白激酶3/胞外信号调节激酶1途径诱导自噬[13]。自噬的异常表达可直接或间接影响脓毒血症诱发的多器官功能障碍。在盲肠结扎术后的小鼠体内，自噬在术后初始阶段增加，随后逐渐减弱[14]。在脂多糖诱导的急性肺损伤模型中，中性粒细胞自噬水平升高，表明该过程中自噬表达水平可能受炎症信号通路的调节[15]。以上研究说明，自噬对脓毒血症诱导的多器官功能障碍有重要的调节作用。

2.1自噬与脓毒性肝脏损伤 在各种动物脓毒血症模型中，肝脏自噬诱导水平最高，其次为心脏和脾脏[16]。钙蛋白酶系统可通过直接裂解包括从自噬体形成到自噬溶酶体降解整个自噬过程的某些Atg蛋白抑制自噬的发生，如裂解后的Atg5水平与钙蛋白酶活化一致是钙蛋白酶介导的自噬功能损害的表现。盲肠结扎术诱导的小鼠脓毒性肝损伤中钙蛋白酶活性增加，而抑制钙蛋白酶可以增加自噬，提示这种蛋白酶活性增加可能是脓毒血症过程中的一种负性自噬调节机制[17]。有学者对缺乏表面活性剂相关蛋白A1和表面活性剂相关蛋白D小鼠的肝组织进行自噬活性检测发现，LC3-Ⅱ和自噬体显著增加，且与野生型小鼠相比，表面活性剂相关蛋白A1和表面活性剂相关蛋白D敲除小鼠的生存率明显升高，表明自噬在脓毒血症诱导的肝损伤中发挥保护作用[18]。另有研究发现，小鼠在脂多糖刺激后出现渐进性肝损伤，4 h后丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶显著升高，随着刺激时间增加，肝组织损伤逐渐加重，6 h后脂多糖成功诱导小鼠急性肝损伤。在急性肝损伤早期(2～4 h)自噬标志物(Atg5、Atg7、Beclin-1、LC3A)表达水平呈上升趋势；在肝衰竭期，自噬标志物表达水平下降[19]。氯喹是一种自噬抑制剂，其能够阻断自噬流，给予脓毒血症小鼠氯喹后，丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平升高，肝组织损伤加重，这进一步证实自噬在脓毒血症诱导肝损伤中发挥保护作用[16]。在早期脓毒血症中，自噬水平升高在肝细胞中发挥保护作用，而晚期自噬水平下降可能与脓毒血症时的肝功能衰竭有关。

2.2自噬与脓毒性心肌损伤 Sun等[20]研究发现，低剂量的脂多糖刺激小鼠后，其心脏中的自噬增加；而在高剂量的脂多糖刺激下，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性增加，自噬减少。心脏特异性过表达自噬基因Beclin-1后，自噬增加，mTOR信号通路被抑制，心脏功能、炎症反应和纤维化均得到改善。Rubicon是一种自噬负性调控因子，其通过抑制Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶C3/Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶的活性抑制自噬体的成熟。有学者用脂多糖刺激Rubicon敲除小鼠发现，其存活时间较野生型小鼠长；超声心动图结果显示，与野生型小鼠相比，Rubicon敲除小鼠在脂多糖刺激12 h后心排血量和自噬明显增加[21]。AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种在细胞能量稳态中发挥作用的酶，其能够调节心脏中的心肌信号。脂多糖可促进心肌组织AMPK上游调节蛋白(蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶2Cα)的表达，随后AMPK的活化可以改善脂多糖诱导心肌自噬的增加，从而改善小鼠心功能不全，其机制为通过调控AMPK/mTOR发挥作用[22]。此外，Zou等[23]认为自噬的削弱可引起心功能障碍并诱导心肌细胞凋亡，脂多糖诱导自噬24 h后心肌细胞开始发生凋亡，而给予3-甲基腺嘌呤抑制溶酶体的形成或直接沉默Atg5均可导致脂多糖刺激4 h后即出现凋亡。以上数据均表明，自噬的增加可以改善脂多糖诱导的心脏毒性。然而也有研究认为，自噬的增加可发挥损害作用[24]。SD大鼠在脂多糖刺激4 h后，TLR4、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4和LC3的表达水平显著升高，且电镜结果、红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-LC3转染结果均显示脂多糖刺激后自噬表达水平升高[24]。肉桂醛是一种从肉桂精油中提取的主要活性成分，研究发现其可通过抑制TLR4-还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4信号通路抑制自噬，从而改善脂多糖诱导的SD大鼠心功能不全，表明自噬的减少在脂多糖诱导的心肌损伤中发挥保护作用[24]。自噬在脓毒血症诱导的心肌损伤中扮演双重角色，其可能与动物模型、刺激物的剂量和水平等相关。

2.3自噬与脓毒性肺损伤 呼吸衰竭通常发生在脓毒血症早期，研究表明脓毒血症早期自噬相关蛋白表达水平的下降与促凋亡蛋白的表达增加有关，自噬诱导剂雷帕霉素可诱导自噬增加，从而减轻细胞凋亡[25]。Zhang等[26]发现，脂多糖可诱导人肺微血管内皮细胞通透性增加，乳酸脱氢酶释放增加，细胞活性降低。当自噬受到抑制后，细胞通透性增加，乳酸脱氢酶释放得更多且细胞活性降低更为明显。动物实验显示，脂多糖可诱导肺组织水肿，白细胞浸润和出血，而减少自噬可加重肺组织水肿和白细胞浸润，提示自噬能够减轻脂多糖诱导的急性肺损伤，其机制可能与限制肺微血管屏障的损伤有关。研究发现，一氧化碳通过增强Beclin-1依赖的自噬在脓毒血症中发挥保护作用，而敲除Beclin-1后，一氧化碳的保护作用受到抑制[27]。羟基酪醇是一种天然多酚类化合物，它通过促进自噬缓解脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺部炎症[28]。可见，自噬在脓毒性肺损伤中发挥重要作用。4-苯基丁酸钠盐是一种内质网抑制剂，其保护作用体现为通过抑制核因子κB信号通路抑制脂多糖诱导的肺组织中的内质网应激和通过作用于丝氨酸/苏氨酸激酶/mTOR通路抑制自噬，其中自噬对细胞生存的影响可能与内质网应激的活化有关[29]。这些研究提示，自噬对脓毒性肺损伤发挥双重作用，其具体机制有待进一步探讨。

2.4自噬与脓毒性肾损伤 为验证自噬在脓毒性肾损伤中的作用，有研究给小鼠进行盲肠穿刺结扎术诱导急性肾损伤。电子显微镜观察发现，脓毒血症小鼠的自噬溶酶体数量随着时间的延长而增加，24 h后自噬溶酶体数量减少，自噬流受阻，肾损伤加重；给予雷帕霉素诱导自噬后，肾功能得到改善[14]。研究表明，脂多糖诱导的小鼠肾小管细胞自噬增加，而氯喹抑制自噬可加重脂多糖诱导急性肾损伤，同样肾近端小管特异性敲除Atg7小鼠表现为进一步恶化的脂多糖诱导的急性肾损伤[30]。替西罗莫司或AMPK诱导自噬增加，可保护内毒血症小鼠近端肾小管和改善肾功能[31]。Escobar等[32]发现，AMPK诱导自噬的活化可减少细胞因子的表达和内皮活化，改善肾功能。以上研究提示，自噬在脓毒血症诱导的急性肾损伤中发挥保护作用。此外，脂多糖可诱导肾细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达增加，自噬体数量增加，而给予3-甲基腺嘌呤可抑制自噬流，减少p65磷酸化，导致泛素化核因子κB抑制剂积累，从而使经典核因子κB通路的活化受到抑制，提示自噬减少可以降低脂多糖诱导的炎症反应和改善肾功能，其保护作用可能依赖于泛素化核因子κB抑制剂的积累[33]。自噬对脓毒性肾损伤双重作用的具体机制尚未清楚，可能与其调控的众多信号通路有关。

3 线粒体自噬与脓毒血症

虽然大部分情况下，自噬在脓毒血症中发挥保护作用，但在应激或病理状态下保护细胞的机制尚不清楚。受损和功能障碍的线粒体不仅可以释放促凋亡因子(细胞色素C)，还是活性氧类产生的主要来源。因此，清除受损的细胞器和功能失调的线粒体有助于自噬维持细胞和组织的生存[34]。sestrin 2是一种应激诱导蛋白，其能使巨噬细胞诱导线粒体自噬来清除受损的线粒体，从而抑制脓毒血症诱导的核结合寡聚化结构域样受体家族嘧啶结构域炎症小体的活化。如敲除sestrin 2的小鼠可检测到线粒体自噬的缺失，其可引起炎症小体的过度活化，从而增加脓毒血症的死亡率[35]。PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin信号通路是线粒体自噬中较为经典的通路，PINK1是一种位于线粒体内膜中的蛋白激酶，其通常维持在低水平状态，一旦被激活即可招募Parkin(具有E3泛素-蛋白连接酶活性的蛋白)转位至受损线粒体的外膜诱导泛素化，泛素化的线粒体在自噬受体调节蛋白调节下被自噬囊泡包裹成线粒体自噬体，随后与溶酶体融合并被水解酶降解[36]。脂多糖诱导小鼠急性心肌损伤后，血清中的心肌肌钙蛋白Ⅰ表达显著增加，而线粒体膜电位呈下降趋势，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达增加，线粒体自噬相关通路PINK1/Parkin在脂多糖刺激6 h前显著增加，随后表现为下降趋势，提示脂多糖诱导心肌损伤的早期，心肌细胞自噬的活化可能发生于心肌线粒体内[37]。脂多糖诱导线粒体去极化增加肝细胞线粒体钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅰ的表达，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶作为PINK1的激酶，通过作用于PINK1/Parkin信号通路对脓毒血症发挥正性调控机制[38]。以上研究均表明，线粒体自噬在脓毒血症中扮演重要角色，因此增强线粒体自噬可能成为治疗脓毒血症的一个重要方法。

4 自噬诱导剂在脓毒血症治疗中的价值

在脓毒血症的晚期自噬受到抑制，自噬活性降低与器官衰竭有关，提示自噬诱导剂可能预防或治疗脓毒血症[39-41]。Liu等[39]应用雷帕霉素处理脓毒血症小鼠发现，小鼠海马体的磷酸化mTOR表达减少，自噬标志物LC3-Ⅱ、Atg5和Atg7表达增加，p62表达减少。同时，雷帕霉素能通过增强自噬改善小鼠脓毒血症后的学习能力，表明雷帕霉素可能是治疗脓毒症所致认知损耗的潜在有效药物。褪黑素是一种内源性吲哚胺类激素，它通过诱导自噬增加，从而减少肌酸激酶和肌酸激酶同工酶的表达，减轻心肌结构破坏，改善心功能[40]。卡马西平作为一种经典抗惊厥药，其能通过激活自噬降低脓毒血症诱导肝细胞凋亡，炎症反应和肝组织损伤，从而改善肝功能[41]。自噬激活在脓毒症中的保护作用机制尚待阐明，脓毒血症的潜在治疗剂的药动学或药效学需要进一步研究，这对脓毒血症中的器官靶向治疗非常重要。

5 小 结

脓毒血症是指由不同微生物入侵机体后导致的不良免疫反应，严重时可导致多器官功能衰竭和细胞死亡。虽然关于脓毒血症的基础实验和临床研究已取得一定进展，但由于其发病涉及机制众多且复杂，故仍具有较高的发病率和死亡率。自噬参与了脓毒血症的病理生理过程，在大多数情况下自噬的活化对脓毒血症发挥保护作用，自噬诱导剂可改善脓毒血症诱导的器官损伤。然而也有研究认为自噬的活化发挥损伤作用[24]，因此其具体机制需进一步探讨。自噬作为一种细胞适应机制，在脓毒血症诱导的多器官功能障碍中发挥重要作用，未来其将为脓毒血症的治疗提供新靶点。