麻杏石甘汤对哮喘模型小鼠气道重塑及肺组织MMP-9和TIMP-1表达的影响*

徐 凤， 张 岩， 商 华， 肖韩艳

(牡丹江医学院第二附属医院， 黑龙江 牡丹江 157011)

支气管哮喘(简称哮喘)是以气道内各种炎症细胞的弥漫性浸润为主要病变的气道炎症性疾病，由多种免疫细胞共同诱发，常常导致气促、胸闷、咳嗽、反复发作的喘息、黏液过量分泌和杯状细胞增生等症状，并伴随气流阻塞，直接影响人体健康[1-2]。西药以糖皮质激素为主的支气管哮喘序贯治疗方案虽写入哮喘防治指南，但是长期使用存在一定的副作用，而中医药防治支气管哮喘具有较好疗效[3-4]。麻杏石甘汤(Maxing-Shigan decoction, MSD)由麻黄、杏仁、石膏和炙甘草组成，麻黄上宣肺气、外散皮毛之邪、下通利水道、内祛脏腑之湿，与杏仁、石膏、炙甘草配伍，清泄肺热、止咳平喘。临床研究表明，麻杏石甘汤能够改善哮喘发作的临床症状及体征，疗效显著，安全性好[5-6]；另有动物实验表明，麻杏石甘汤可能通过抑制白细胞介素13/信号转导及转录激活因子6/黏蛋白途径减轻哮喘大鼠炎症反应，也可能通过调控Sec14l3在肺组织的表达水平有效减轻哮喘大鼠气道炎症的程度[7-8]。但是有关于麻杏石甘汤对哮喘模型气道重塑的影响的研究则鲜见报道。因此，本研究观察了麻杏石甘汤对哮喘模型小鼠气道重塑的影响，并进一步观察了麻杏石甘汤对哮喘模型小鼠肺组织基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和金属蛋白酶组织抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)表达的影响，探讨MMP-9和TIMP-1在哮喘小鼠气道重塑方面的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1实验动物 72只健康BALB/c雌性小鼠，SPF级，体质量(25±2) g，购自哈尔滨医科大学动物实验中心。本实验方案遵循动物福利和伦理原则，经过牡丹江医学院动物伦理委员会标准(编号：MMU2013-16)审查，符合伦理规范要求。

1.2麻杏石甘汤的制备 麻杏石甘汤由麻黄12 g、杏仁9 g、石膏18 g和炙甘草6 g组成：首先以1 L双蒸水浸泡麻黄0.5 h，煮沸1 h，掠去上沫，然后再同杏仁、石膏(用纱布包裹)和炙甘草煮沸0.5 h，3 000 r/min离心10 min，弃沉渣，取上清。生理盐水调配至浓度1 kg/L，4 ℃储存，待用。临用前加热至常温，以生理盐水稀释至1 kg/L、0.5 kg/L和0.25 kg/L。

1.3主要试剂 卵清蛋白购自Sigma；地塞米松磷酸钠注射液购自天津金耀药业有限公司；MMP-9和TIMP-1 ELISA检测试剂盒购自ADL；羊抗小鼠MMP-9多克隆抗体及兔抗小鼠TIMP-1多克隆抗体购自Affinity；辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG购自上海榕柏生物技术有限公司。

1.4主要仪器 超声雾化器(402A，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；自动平衡离心机(LDZ5-2，北京京立离心机有限公司)；动物无创肺功能检测系统(FinePointeTMNAM，Buxco)；光学显微镜(BH-2，Olympus)；电子天平(UW820S，Shimadzu)。

2 方法

2.1动物分组和小鼠哮喘模型的建立 将小鼠随机分为空白对照(blank control)组、模型(model)组、麻杏石甘汤低剂量(low-dose MSD)组、麻杏石甘汤中剂量(middle-dose MSD)组、麻杏石甘汤高剂量(high-dose MSD)组和阳性对照(positive control)组，每组12只。除空白对照组外，于第1天和第8天皮下注射10 mg卵清蛋白和200 mg氢氧化铝凝胶，从第15天开始，将全部小鼠放置到超声雾化器中，以2%卵清蛋白生理盐水雾化激发哮喘。空白对照组均以不含卵清蛋白的生理盐水替换，每天1次，每次约30 min，共连续激发8 周。空白对照组和模型组于激发前30 min以生理盐水灌胃。以60 kg成人每日服用药物剂量与小鼠体表面积换算比值换算出小鼠1 d用量，计算出各药物组的临床等效剂量并参照文献[9-10]及预实验结果作为中剂量。麻杏石甘汤低剂量组、中剂量组和高剂量组于激发前30 min以麻杏石甘汤按5.0 g/kg、10.0 g/kg和20.0 g/kg剂量灌胃；阳性对照组于激发前30 min以地塞米松按0.005 g/kg剂量灌胃，每天1次，共连续给药7 d。

2.2气道反应性的测定[11]最后1次给药2 h后进行气道反应性测定，连接动物无创肺功能检测系统。将小鼠置于体描箱内，适应5 min。给予不同浓度(依次为6.25、12.5、25和50 g/L)的乙酰甲胆碱(methacholine，MCh)，每个剂量间隔5 min以上，记录各组小鼠增强呼吸间歇(enhanced pause，Penh)值评价气道阻力，Penh(%)=(呼气时间/松弛时间-1)×最大呼吸流量/最大吸气量×100%。

2.3标本制备和嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)计数 气道反应性测定完成后，各组小鼠麻醉，结扎右侧主支气管，经气管插管，以4 ℃预冷的无菌Hanks 液行支气管肺泡灌洗6次，每次0.5 mL，回收率约80%。收集到的支气管肺泡冲洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)经3 000 r/min 离心 10 min，取沉渣经生理盐水重悬，取10 μL以Diff-Quik 染色液染色BALF细胞涂片后用于EOS计数。随机取6只小鼠，切取右肺上叶，用于高碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色和Masson染色。剩余6只小鼠，切取右肺门部位组织用于ELISA测定及Western blot 和RT-qPCR分析。

2.4组织学检查 肺组织经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片(5 μm)，分别进行PAS 染色和Masson染色。采集图像用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件测定杯状细胞百分比(%)，以杯状细胞占所在支气管上皮细胞的比例表示气道的黏液分泌能力；测定上皮下Masson 阳性面积(μm2)和支气管基底膜周长(μm)，计算Masson阳性面积/支气管基底膜周长比(μm2/μm)，以表示胶原沉积情况。

2.5肺组织MMP-9和TIMP-1蛋白水平的测定 取约1/3右肺组织剪碎匀浆，严格按照ELISA试剂盒的操作说明测定肺组织MMP-9和TIMP-1水平。另取约1/3右肺组织剪碎匀浆，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按照常规操作方法进行电泳、转膜。分别加入 I 抗(1∶500稀释)孵育1 h；PBST洗涤后，加入 II 抗(1∶2 000稀释)孵育1 h,以GAPDH为内参照。每份样品设5个平行孔。用Odyssey 荧光扫描仪扫描。

2.6RT-qPCR 分析肺组织MMP-9和TIMP-1的mRNA水平 参照TRIzol试剂说明书进行剩余肺组织总RNA 提取，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。用cDNA 模板对相关基因分别进行PCR 扩增。引物序列见表1。反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s、59 ℃退火30 s、72℃延伸60 s，35个循环;再72 ℃延伸10 min。每个样本以内参照GAPDH调整。每份样品检测5次。采用2-ΔΔCt法测定mRNA相对表达水平。

表1 RT-qPCR 引物序列

3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行描述性统计。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示。两因素析因设计方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用Bonferroni检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 麻杏石甘汤对哮喘模型小鼠气道反应性的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠气道反应性显著升高(P<0.01)；与模型组比较，麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组小鼠气道反应性均显著降低(P<0.05或P<0.01),见表2。

表2 各组小鼠Penh 值的比较

**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

2 麻杏石甘汤对哮喘模型小鼠组织学的影响

PAS染色结果显示，空白对照组少见杯状细胞；模型组可见明显杯状细胞；麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组的杯状细胞较模型组显著减少，见图1。图像分析结果显示，模型组小鼠的杯状细胞百分比显著升高，与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组小鼠的杯状细胞百分比均显著降低，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见图2。Masson染色结果显示空白对照组少见胶原沉积；模型组可见明显胶原沉积；麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组的胶原沉积显著减少，见图1。图像分析结果显示，模型组小鼠Masson染色阳性面积/支气管基底膜周长比与空白对照组比较显著增大，差异具有统计学意义(P<0.01)，而麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组的Masson染色阳性面积/支气管基底膜周长比显著减小(P<0.05或P<0.01)，见图2。以上结果提示麻杏石甘汤可显著降低哮喘模型小鼠胶原沉积。

Figure 1.The results of PAS staining and Masson staining in lung tissues of different groups (×200).

图1各组小鼠肺组织PAS染色和Masson染色结果

Figure 2.The results of the goblet cell percentage and the collagen deposition in the lung tissues of different groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图2各组小鼠肺组织杯状细胞百分比和胶原沉积结果的比较

3 麻杏石甘汤对哮喘模型小鼠BALF中EOS计数的影响

BALF中EOS计数结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠EOS计数显著升高(P<0.01)；与模型组比较，麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组小鼠EOS计数均显著降低(P<0.05或P<0.01)，见图3。

4 ELISA检测哮喘模型小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1水平的变化

ELISA结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠MMP-9和TIMP-1水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组小鼠MMP-9和TIMP-1水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)，见图4。

5 Western blot检测哮喘模型小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1表达的变化

Figure 3.The results of the EOS counts in the BALF of different groups. Mean±SD.n=12.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图3各组小鼠BALF中EOS计数的比较

Figure 4.The ELISA results of the MMP-9 and TIMP-1 levels in the lung tissues of different groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图4ELISA检测各组小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1的蛋白水平

Western blot结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠MMP-9和TIMP-1表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较,麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组小鼠MMP-9和TIMP-1表达均显著降低(P<0.05或P<0.01),见图5。

Figure 5.The protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in the lung tissues of different groups determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图5Westernblot检测各组小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1的蛋白表达

6 哮喘模型小鼠肺组织MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表达的变化

RT-qPCR结果显示，模型组小鼠MMP-9 和TIMP-1的mRNA表达显著升高，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，麻杏石甘汤各剂量组和阳性对照组小鼠MMP-9 和TIMP-1的mRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)，见图6。

Figure 6.The mRNA expression of MMP-9 and TIMP-1 in the lung tissues of different groups detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

图6RT-qPCR检测各组小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1的mRNA表达水平

讨 论

气道高反应性是哮喘发生发展过程中的重要因素，当炎症细胞激活和(或)炎症介质释放即会导致气道高反应性[12-13]。本研究结果显示，麻杏石甘汤可有效降低哮喘模型小鼠气道反应性；同时本研究中组织学也发现，各剂量的麻杏石甘汤均可以抑制哮喘模型小鼠肺组织杯状细胞百分比及上皮下胶原沉积。以上结果说明，麻杏石甘汤可有效抑制哮喘模型小鼠气道反应性和气道重塑，减轻哮喘症状。

气道的炎症和重塑是哮喘的特征性病理改变[14]。气道重塑被认为可能成为防治哮喘的新靶点，其发生基础以气道慢性炎症为特征，是炎症慢性发展的最终结果之一[15]。研究表明，在哮喘气道组织中存在大量的炎症细胞浸润，如EOS。当EOS分泌嗜酸性细胞阳离子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)，即可刺激成纤维细胞分泌转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，合成和分泌大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)并沉积，导致气道壁增厚而引起气道重塑。本研究结果显示，模型组小鼠BALF中EOS计数较空白对照组明显增加，说明模型组小鼠BALF中EOS升高；而麻杏石甘汤各剂量组小鼠BALF中EOS计数较模型组降低。以上结果提示，麻杏石甘汤抑制哮喘模型小鼠气道重塑与其抑制慢性气道炎症密切相关，同时，也进一步证明麻杏石甘汤具有明显的体内抗炎作用[7-8]。

气道重塑是一个复杂的过程，主要改变包括上皮损伤、上皮下纤维化、气道平滑肌增生、杯状细胞肥大和增生以及血管生成等，其中最显著的异常改变是ECM分子的过度产生和沉积[16]。ECM的动态环境主要由基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)维持。MMPs是调节ECM代谢的主要限速酶，能够特异性降解ECM，参与多种生理和病理生理过程，为一个大家族。MMPs家族中与哮喘关系最密切相关的有MMP-9和TIMP-1,TIMP-l是MMP-9的特异性抑制物，可通过抑制MMP-9的活性而保护气管基质蛋白不被降解，二者共同维持着正常基质和机体内环境的稳定[17-18]。MMP-9与TIMP-1的失衡是引起ECM降解和气道重塑的重要原因。MMP-9通过影响EOS等炎症细胞的迁移、ECM沉积和基质中胶原的降解，在气道重塑中起关键作用[19-20];而TIMP-1通过与MMP-9的催化位点结合而抑制MMP-9活性，使降解产物在黏膜下层聚集，导致气道壁增厚，促进气道重塑的发生发展，被认为是哮喘发生气道重塑现象的标志[21]。故此，调节MMP-9及TIMP-1的水平可能是抑制哮喘气道重塑的有效方法。本研究结果显示，模型组小鼠MMP-9和TIMP-1水平较空白对照组均升高，与以往研究结果相一致[22]。麻杏石甘汤各剂量组小鼠MMP-9和TIMP-1水平均较模型组降低。以上结果均说明，麻杏石甘汤可能通过抑制MMP-9和TIMP-1表达而抑制哮喘模型小鼠气道重塑。

综上所述，麻杏石甘汤可有效降低哮喘模型小鼠的气道高反应性，同时也具有抑制气道重塑的作用，其机制可能与其抑制MMP-9和TIMP-1表达有关。本研究的局限之处在于并未探讨拆方的作用。至于其拆方对哮喘模型小鼠气道重塑的作用及可能机制，将作进一步的探讨。