Smad4对HEC凋亡的影响及机制研究

李 飞，周志强，吴成稳，康海涵，梁晓丹，蔡亚征, 张 毅

血管瘤(hemangioma，HEM)是一种良性肿瘤，不仅影响患者的容貌，还能够影响相关组织器官正常功能的发挥，HEM有较为明显的消退期、平台期和增生期，头颈部的发病率最高，血管瘤内皮细胞(hemangioma endothelial cells,HEC)是HEM发生主要原因，诱导HEC凋亡是治疗HEM的重要途径[1-2]。胰腺癌缺失基因(deleted in pancreatic cancer locus 4,DPC4/Smad4)有诱导细胞凋亡，抑制细胞生长的作用，在白血病细胞、前列腺癌细胞、脐静脉内皮细胞等多种细胞中已经证实[3-5]。Smad4在增生期HEM组织中的表达水平低于退化期HEM组织，Smad4可能参与HEC凋亡[6]。该实验通过体外分离培养增生期的HEC，通过细胞转染的方法上调HEC中Smad4的表达，探讨Smad4在增生期HEC凋亡中的作用，为明确HEM发生机制提供参考。

1 材料与方法

1.1材料二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)法活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量测定试剂盒购自上海翊圣生物公司；pcDNA3.1-Smad4由郑州大学第二附属医院中心实验室构建；Lipofectamine 2000购自美国invitrogen公司；荧光定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司；ECL显色试剂购自北京Solarbio公司；细胞周期测定试剂盒、细胞凋亡测定试剂盒购自上海碧云天公司；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)抗体购自美国CTS公司；细胞周期依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)抗体购自美国Santa Cruz公司；细胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗体购自天津saierbio公司；Smad4抗体购自美国ABACM公司。

1.2HEC分离培养及分组新鲜增生期HEM组织标本来自郑州大学第二附属医院，组织采集经患者及家属同意。增生期HEC分离培养步骤同文献[7]，取增生期HEM组织，用PBS反复洗涤至溶液清亮，把周围的皮肤和脂肪组织去除，剪成大小约为1～2 cm3的组织碎块，置于0.25%的胰蛋白酶中，在37 ℃的水浴中消化20 min。用含胎牛血清的M199终止消化，把消化后的组织块剪碎成≤1 mm×1 mm×1 mm的小碎块，种植到培养瓶内，把培养瓶倒置培养10 min后，加入培养液，使培养液完全覆盖组织块，3 d后换液，6 d后把组织块清除掉，9 d传代培养(0.25%胰蛋白酶传代)。HEC中转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4记为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-Smad4组，同时把未做转染处理的HEC记为Control组，具体转染方法同Lipofectamine 2000脂质体转染说明书。

1.3qRT-PCR测定HEC中Smad4表达Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4组细胞培养24 h，以每106个细胞添加1 ml的TRIzol将各组HEC裂解以后，与200 μl的氯仿混合后，吸取上层水相溶液，再与500 μl的异丙醇混合，低温，高速离心后，用75%的乙醇洗涤RNA，用RNase-free水溶解后，测定吸光度(optical density,OD)值260 nm和OD 280 nm的比值，比值介于1.8～2.0之间。逆转录合成cDNA，反应条件为：25 ℃、5 min；42 ℃、60 min；75 ℃、5 min。 取cDNA，进行荧光定量PCR扩增，步骤同试剂盒说明书，用2-ΔΔCt法计算各组样品中Smad4水平，GAPDH为参照。

1.4Westernblot测定HEC中Smad4表达Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4组细胞培养24 h，用预冷的PBS洗涤后，每个细胞瓶中添加含有PMSF的裂解液500 μl，放在冰上裂解30 min后，低温高速离心10 min。把上清液转移至EP管中，用BCA法检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE蛋白电泳，电泳电压为90 V，每孔上样量为30 μg。用半干法把凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，100 mA电流转膜50 min。用5%牛血清白蛋白封闭后与抗体孵育，Smad4一抗1 ∶600稀释，GAPDH一抗1 ∶1 000稀释，二抗1 ∶2 000稀释，DAB显色。对蛋白条带进行半定量分析，目的蛋白同GAPDH内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5MTT测定HEC增殖活性Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4组细胞种植到96孔板中，在第24、48、72、96小时取出培养板，在细胞内加MTT溶液，培养4 h，将上清液去掉，再添加DMSO，用酶标仪检测每孔在490 nm的OD值。

1.6流式细胞仪检测细胞周期Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4组细胞在转染以后24 h，用胰蛋白酶消化，转移到流式管内，低速离心10 min，把上清液去掉，添加75%甲醇，置于4 ℃过夜反应，低速离心10 min，加入PI，置于4 ℃反应30 min，流式细胞仪测定HEC周期。

1.7流式细胞仪检测细胞凋亡Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4组细胞在转染以后24 h，用胰蛋白酶消化，与400 μl的结合缓冲液混合后，再与PI和Annexin V-FITC反应后，流式细胞仪检测HEC凋亡。

1.8Westernblot检测细胞中CleavedCaspase-3、CDK4、CyclinD1蛋白水平Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4组细胞在转染以后24 h，用胰蛋白酶消化，Western blot法检测Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平，Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1一抗以1 ∶600稀释，其他步骤同上。

1.9DCFH-DA法检测细胞中ROS水平Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4组细胞在转染以后24 h，用DCFH-DA法检测细胞中ROS水平，步骤同ROS含量测定试剂盒，以Control组为1，分析各组细胞ROS水平。

2 结果

2.1细胞转染后HEC中Smad4表达HEC中转染pcDNA3.1-Smad4后，细胞中Smad4 mRNA和蛋白水平均升高，而转染pcDNA3.1对HEC中Smad4 mRNA和蛋白水平没有影响，见图1、表1。

图1 Western blot测定转染后的HEC中Smad4蛋白表达情况

表1 各组HEC中Smad4水平

与Control组比较：*P<0.05

2.2Smad4对HEC增殖的影响HEC中转染pcDNA3.1-Smad4后，细胞OD值降低，而转染pcDNA3.1对HEC OD值没有影响，见表2。过表达Smad4可以降低HEC的增殖活性。

2.3Smad4对HEC周期的影响HEC中转染pcDNA3.1-Smad4后，细胞G0/G1期比例升高，而转染pcDNA3.1对HEC周期没有影响，见表3。过表达Smad4可以将HEC周期阻滞在G0/G1期。

2.4Smad4对HEC凋亡的影响HEC中转染pcD-NA3.1-Smad4后，细胞凋亡率升高，而转染pcDNA3.1对HEC凋亡率没有影响，见图2、表4。过表达Smad4诱导HEC凋亡。

表2 各组HEC OD值

与Control比较：*P<0.05

图2 流式细胞仪测定Smad4诱导的HEC凋亡情况

表3 各组HEC周期

与Control组比较：*P<0.05

表4 各组HEC凋亡率

与Control组比较：*P<0.05

2.5Smad4对HEC中Caspase-3、CDK4、CyclinD1表达的影响HEC中转染pcDNA3.1-Smad4后，细胞中Cleaved Caspase-3水平升高，CDK4、Cyclin D1蛋白水平下降，而转染pcDNA3.1对HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平没有影响，见图3、表5。过表达Smad4诱导HEC中Caspase-3活化，减少细胞中CDK4、Cyclin D1蛋白表达。

图3 Western blot检测HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平

2.6Smad4对HEC中ROS水平的影响Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4组细胞中ROS水平依次为：1.00、(1.01±0.07)、(1.76±0.18)，3组比较差异有统计学意义(F=45.853,P=0.000)。HEC中转染pcDNA3.1-Smad4后，细胞中ROS水平升高，而转染pcDNA3.1对HEC中ROS水平没有影响， 见图4。过表达Smad4诱导HEC中ROS合成。

表5 各组HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平

与Control组比较：*P<0.05

图4 各组HEC中ROS水平

3 讨论

本实验的结果显示，Smad4过表达后的HEC中CDK4和Cyclin D1蛋白表达水平降低，细胞周期被阻滞在G0/G1期，提示Smad4通过减少CDK4和Cyclin D1表达阻滞HEC周期，抑制HEC增殖；同时结果还表明，Smad4过表达后的HEC中Caspase-3活化增多，细胞凋亡率升高，提示Smad4可以通过激活Caspase-3的活化诱导HEC凋亡；Smad4诱导HEC中ROS水平升高，这可能是Smad4诱导HEC凋亡的机制之一。

Smad名字来源于果蝇Mad蛋白和线虫Sma蛋白，Smad蛋白家族在信号转导中发挥重要作用，是与转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)有关的效应因子，参与细胞内信号转导过程，在哺乳动物体内发现了至少9种Smad蛋白成员，Smad4是目前确认的共同通道型Smad，是一种抑癌基因，可以与几乎所有的活化途径Smad蛋白相结合，形成低聚体的复合物，在TGF-β信号调节中发挥关键作用[8]。Smad4含有一个MH2结构域，MH2由β片层夹心、三环α螺旋和三螺旋束构成，这个区域的氨基酸序列高度保守，在分子识别中具有重要作用，而这个区域内蛋白与蛋白之间作用界面是突变发生的重要区域，多数肿瘤在该区域内均有不同程度的突变[9]。Smad4的异常表达与胰腺癌等肿瘤的发生有关，并且可以诱导细胞的凋亡，降低细胞的增殖能力[10]。TGF-β与HEC的生长和凋亡有关，而Smad4在增生期的HEM组织表达水平低于退化期的HEM组织，提示Smad4可能参与HEC的凋亡[6]。 本实验结果证实了Smad4在HEM内皮细胞凋中的作用，这与上述研究结果一致。

细胞周期可以分为细胞间期和分裂期，而间期又可以分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2期(DNA合成后期)，M期是细胞分裂期，G0期是细胞停止分裂，处于发挥其生物学功能阶段的细胞，细胞周期的调控与细胞内周期蛋白有关，其中CDK4和Cyclin D1表达减少可以诱导细胞周期阻滞在G0/G1期，Cyclin D1能够与CDK4形成复合物，诱导细胞进入S期[11]。研究[12]显示，Smad4可以抑制子宫内膜癌细胞生长，把细胞周期阻滞在G0/G1期，发挥抗肿瘤作用。Caspase参与细胞凋亡调控，是一个半胱氨酸蛋白酶家族，几乎参与所有的细胞凋亡信号转导，其蛋白家族的成员组成一个类似瀑布的反应，诱导细胞凋亡的发生。Caspase-3是该蛋白家族的重要成员之一，在正常细胞和肿瘤细胞中其以没有活性的酶原存在，而当诱导细胞凋亡的信号转导至Caspase反应后，Caspase-3被激活，诱导细胞凋亡发生[13]。Smad4可以激活Caspase-3最终诱导乳腺癌、胶质瘤等细胞凋亡[14]。ROS广泛存在于细胞内，其既可以作用一种信号转导分子调控细胞生物学行为，又可以维持细胞内的氧化平衡，而当细胞内的ROS水平过度升高后，会打破细胞内的氧化平衡状态，对细胞造成损伤，引起细胞凋亡发生[15]。本实验结果证实Smad4可以通过提高HEC中ROS水平激活Caspase凋亡反应，通过影响细胞周期调控蛋白的表达抑制HEC增殖，这可能是Smad4抗HEC生长的机制。

综上，Smad4在HEM生长中发挥抑制作用，Smad4可能通过阻滞细胞周期抑制HEC增殖，通过促进细胞中ROS积累激活Caspase凋亡反应诱导HEC凋亡发生，这对于研究Smad4在HEM发生中的作用机制奠定了基础，为研究HEM发生的作用机制提供了参考。本实验存在一定的局限性，Smad4具体的靶向作用机制尚未研究，Smad4的作用机制没有在体内进行验证，后续实验将对上述部分进行探讨。