LC-MS/MS检测动物源性食品中β-激动剂类是否需要酶解

2019-03-10 19:35辛堃杨桂霞李淑敏葛明华
食品界 2019年2期
关键词:伦特罗莱克瘦肉精

辛堃 杨桂霞 李淑敏 葛明华

本实验对β-激动剂是否需要酶解进行了实验说明,结果表明克伦特罗和沙丁胺醇不需要酶解就能被提取出,而莱克多巴胺在不酶解时提取效率低。本实验对酶解时间和酶解温度进行了优化,在40℃下酶解2h时,三种瘦肉精的回收率和精密度均能满足实验要求,提高了检验效率。

瘦肉精是一类药物的统称,用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病,大剂量用在饲料中可以促进猪的增长,减少脂肪含量,提高瘦肉率,但食用含有瘦肉精的猪肉对人体有害,在我国已经禁用。瘦肉精是一种肾上腺类受体激动剂(神经兴奋剂),即β-受体激动剂,如克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。“瘦肉精”化学性質稳定,加热到172 ℃时才分解,因此,一般烧煮加热方法不能将其破坏。如果长期食用含有瘦肉精的肉,会导致染色体畸变的可能,诱发恶性肿瘤,造成安全隐患。

β-受体激动剂大多有苯乙胺醇和叔丁基或异丙基连接而成的,一般可分为苯胺基、苯酚、淀粉三种类型,对于苯酚、淀粉苯环上那个羟基是结合的位点,β-受体激动剂在体内代谢完,会跟羟基结合,形成一个葡萄糖醛苷的代谢物,需要酶解游离出来,才能进行检测。而不同的化合物,蛋白结合率也不相同。根据苯环上取代基的差异,克伦特罗属于苯胺型结构轭合反应率和蛋白结合率低。但苯酚型的轭合代谢过程较强,如沙丁胺醇在组织和排泄物中主要以硫酸轭合物的形式存在,其次为葡萄糖醛酸轭化物;特布他林主要为硫酸轭化物;莱克多巴胺主要以葡萄糖醛酸轭化物形式存在。苯胺型结构的化合物在酸性环境下很容易由结合态转变为游离态,所以有些标准对猪尿的检测就没有酶解这一步;莱克多巴胺苯酚型β-受体激动剂轭合代谢过程较强与蛋白结合率高,所以检测时是需要酶解的。在肝脏组织中β-受体激动剂与蛋白结合率高、残留量大,实验时也需要酶解。

现行有效的β-受体激动剂类检测标准主要有GB/T 21313- 2007、GB/T 22286- 2008、SN/T 1924- 2011和农业部1025号公告- 18-2008,四种方法均采用37℃下避光酶解16 h的方式把与蛋白结合的目标化合物释放出来。考虑到实验长,是否可以不进行酶解或者缩短酶解时间来提升实验室检测效率呢?本文通过实验进行了论证,如下。

实验部分

依据检测方法在加标浓度为1ng/mL、2ng/ mL、5ng/mL时、回收率为85.0%~110.0%,相对标准偏差小于5%。标曲在浓度范围0.5~10μg/kg 时线性关系良好(2 r> 0.995)。

主要仪器:Agilent 液相色谱 - 质谱联用仪(1260- 6460);高速动能均质仪(IKA:T25);离心机(sigma:3- 18KS);氮吹仪(Organomation:N- EVAP 112);恒温水浴摇床(上海博讯:HHS- 21- 8);涡旋混合器(上海精科:XW- 80A);电子天平(赛多利斯:BSA224S);pH计(赛多利斯:PB-10)。

标准品及标准曲线配制:莱克多巴胺盐酸盐;氘代莱克多巴胺(d6);盐酸克伦特罗;克伦特罗- D9;沙丁胺醇;沙丁胺醇- D3,均使用德国Dr.Ehrenstorfer标准品。用甲醇溶解各标准品并稀释成20 ng/mL的外标混合工作液和100 ng/mL内标混合工作液。用初始流动相配制成0.5、1、2、5、10 ng/mL的标准工作曲线。

样品前处理:取三种有代表性可食部分肌肉组织阳性样品(非加标)500 g,用组织捣碎机充分捣碎均匀,每个阳性样品称取3个平行样进行酶解与不酶解的比对试验,A为沙丁胺醇阳性样品,B为克伦特罗阳性样品,C为莱克多巴胺阳性样品。称样2.0 g样品于50 mL离心管中,加入50 μL 100 ng/mL内标混合工作液,40 μLβ-葡萄糖酫苷酶,再加入20 mL 2.0 mol/L乙酸铵缓冲液(乙酸调节PH为5.2),涡旋1分钟后放入37℃水浴震荡器中避光过夜酶解16小时。取出离心管放置室温,于9000转高速离心,取上清液于另一50 mL离心管中,加入20 mL乙腈饱和的正己烷脱脂,涡旋振荡10 min,于9000转高速离心,取下清液过滤纸至另一离心管中,2 mL乙酸铵缓冲液洗涤滤纸,待净化。净化过程:使用混合阳离子交换固相萃取柱(Cleanert PCX 60 mg/3 mL),依次用3 mL甲醇,3 mL水,3 mL 0.1% Hcl进行活化,加载过样,再依次加入3 mL0.1% Hcl,3 mL水,3 mL 50%甲醇水溶液进行淋洗。洗脱:将净化柱放置10 mL离心管上,加入5 mL(95:5)的甲醇-氨水,50℃下氮气吹干,用1mL 0.1%甲酸溶液溶解残渣,注射器吸取后过0.22 μm水系膜于进样瓶中,待检测。

仪器条件。液相条件:色谱柱:Poroshell 120 EC- C18 3.0×50 mm 2.7- Micron流动相A(0.1%甲酸水)B(乙腈);梯度条件:0- 1 min A 90%- 60%;1- 3 min A 60%- 5%;3- 5 min A 5%- 5%;5- 7 min 5%- 90%。离子源为电喷雾离子源;正离子模式下多重反应检测;毛细管电压:4000 V;离子源温度:350 ℃;脱溶剂气压力:40 psi;脱溶剂气流量11 L/ min。MRM 分析参数见表1。

检测结果及分析讨论:通过试验得出克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺在0.5- 10μg/ L的范围内线性关系良好,R2均大于0.998以上。见表2。

提取三种化合物的质谱图发现三种标准物质无论在响应值、分离度和准确度方面都已经达到适合检验的条件,检验结果比较满意,提取前后某一段的MRM 图,按照信噪比S/N三倍确定最低检出限来看,本方法检出限可以达到0.1μg/L。图谱见图1:

实验对沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺在37℃下酶解16h的检测结果与不酶解时的检测结果和结果偏差做出了汇总,见表3。

根据不酶解测得的检测数据可以看出三种瘦肉精不酶解也是有一定提取效果的,克伦特罗和沙丁胺醇酶解与不酶解差别比较小,其结果相对偏差沙丁胺醇为9.3%、克伦特罗为6.9%,而莱克多巴胺酶解与不酶解的偏差为77.2%;如果我们认为37℃酶解16 h三种瘦肉精的提取率为100%的话,那么不酶解时沙丁胺醇提取率为91.1%;克伦特罗提取率为93.3%;莱克多巴胺提取率为44.3%。

由表3检测结果得出结论,不酶解时,肌肉组织样品中的克伦特罗和沙丁胺醇在2mol/L乙酸铵溶液中(乙酸调节PH为5.2)有90%左右被提取出,而莱克多巴胺只有40%左右被转化成了游离态被提取到,还有60%左右以结合态留存在肌肉组织中。也就是说,实验室可以省掉酶解过程直接对克伦特罗和沙丁胺醇这两种化合物进行初筛,而莱克多巴胺在不酶解的情况下提取率不理想。

近年來市场推出的QuEChERS 多兽残提取包产品,其检测范围中也有β-受体激动剂类化合物和对应的回收率,本实验分别用阴性样品加标回收和非加标阳性样品A、B、C按QuEChERS方法作业指导书进行实验比对,结果得出阴性加标样品回收率在75- 90%之间,而非加标阳性样品与酶解16 h结果比对,回收率在40- 70%之间。又因为提取液未经固相萃取柱浓缩净化,并且提取液大多为纯机溶剂,造成上机后噪音高、峰型变宽、平行样之间的离子丰度比稳定性差等一些问题,检验精密度较低。

不酶解时,肌肉组织样品中的克伦特罗和沙丁胺醇在2 mol/L乙酸铵溶液中(乙酸调节PH为5.2)有90%左右被提取出,实验室可以省掉酶解过程直接对克伦特罗和沙丁胺醇这两种化合物进行初筛,而莱克多巴胺在不酶解的情况下提取率不理想。

本实验优化了酶解温度和酶解时间,当在40℃下避光水浴酶解2 h时,通过实验测得三种瘦肉精的回收率、提取率、和精密度均能满足实验要求,缩短了实验室前处理时间,提高了检测效率。

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