瞬时沉默乙醛脱氢酶对辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能的影响

王俪颖,梁涛,朱彤彤,马艳飞,江伟霖,冀瑞卿*,张修国*



瞬时沉默乙醛脱氢酶对辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能的影响

王俪颖1,梁涛1,朱彤彤2,马艳飞2,江伟霖2,冀瑞卿1*,张修国2*

1. 吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心, 吉林 长春 130118 2. 山东省蔬菜病虫生物学重点实验室 山东农业大学植物保护学院, 山东 泰安 271018

辣椒疫霉菌（）产生的效应因子RxLR129113在本氏烟上的功能之一是抑制BAX引起的细胞坏死，而且已经证实乙醛脱氢酶（ALDH）是RxLR129113的互作蛋白。为了探究乙醛脱氢酶（ALDH）是否影响Rx LR129113抑制BAX引起的细胞坏死，本研究利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，克隆了乙醛脱氢酶（ALDH）基因片段，插入到烟草脆裂病毒载体（TRV）中，构建了pTRV -ALDH的VIGS载体，转入农杆菌侵染本氏烟后qrt-PCR验证成功沉默了ALDH基因。在沉默ALDH基因的本氏烟上瞬时表达RxLR129113，24 h接种BAX。结果表明，在NbALDH沉默植株上，RxLR129113仍然抑制BAX引起的细胞坏死。本研究结果表明RxLR129113与ALDH互作不影响其抑制BAX引起的细胞坏死，为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能机制研究奠定了基础。

辣椒疫霉; 实时荧光定量PCR; 基因沉默（VIGS）技术; 表达量

辣椒疫霉菌() 是一种农业生产上重要的土传病原菌，可引起辣椒、甜椒、黄瓜、茄子、大豆等9科20多种作物的茎腐、根腐和枯萎[1]。卵菌侵染寄主植物时会分泌大量的效应分子，依据效应蛋白分子在植物细胞的靶标位点，可将其划分为两大类群，一类是胞间效应蛋白（Apoplastic effector），在植物细胞间累积，通过与胞间靶标蛋白或细胞膜受体结合发生作用；另一类是胞内效应蛋白（Cytoplasmic effector）[2]，分泌病菌胞外后，转至寄主植物细胞内，通过作用于寄主植物胞内靶标抑制寄主的防卫反应，或被植物抗病蛋白识别激发过敏性坏死反应，如卵菌效应蛋白Avr1b和Avr3a，均可被寄主抗病蛋白识别，激发过敏性坏死反应。其中RxLR效应分子属于胞内效应蛋白。RxLR效应分子的N端有一段RxLR-dEER基序的基因序列[3]，其中x为任意氨基酸。研究发现，卵菌含有RxLR-dEER基序的效应蛋白在病原物与植物互作过程中具有抑制植物防卫反应的作用，其模式蛋白分为两个功能区：N端区，包括信号肽和RxLR motif起到外泌和定位的作用，其余的C端区则表现效应因子的活性区，常有W、Y、L、K保守域[4]。

病毒诱导的基因沉默（VIGS）是发现于高等植物的转录后基因沉默现象，是宿主抵抗病毒的一种自我保护机制[5]。病毒侵染植物组织后进行复制，合成大量的双链RNA中间体（Double stranded RNA，dsRNA），随之宿主体内具有核酸内切酶活性的Dicer类似物将其切割为小分子干扰RNA（small interfering RNA，si RNA），si RNA与一系列AGO（argonaute）家族蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），后者特异性识别细胞质中的同源mRNA，并将其切割降解，从而发生基因在转录水平的沉默[6-8]。病毒诱导的基因沉默技术是近年发展起来研究植物基因功能的新方法[9]。利用含有目的基因片段的病毒载体侵染植物，导致植物体内相应的基因表达受到抑制成为沉默基因，可以初步推测目的基因的功能。与转基因、基因敲除等基因功能研究方法相比，VIGS技术具有研究周期短、不需要遗传转化、低成本、高通量的优势，已被广泛应用于植物生长发育以及代谢调控途径相关基因的功能鉴定[10]。

烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）是目前应用最广泛的VIGS载体，它便于外源序列的插入和随后对植物的侵染，具有病毒感染症状轻、沉默效率高等优点，在烟草、拟南芥等多种植物上得到了广泛应用[11]。RxLR129113与乙醛脱氢酶（ALDH）通过酵母双杂，Co-IP和双分子荧光证明互作。本实验以乙醛脱氢酶（ALDH）为沉默对象，实验室本氏烟为供试材料，进而在已沉默乙醛脱氢酶（ALDH）的本氏烟上验证RxLR129113是否抑制BAX引起的坏死。研究结果为RxLR129113与乙醛脱氢酶（ALDH）的互作机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试烟草为本实验室保存的本氏烟。本氏烟种植于温室，温度25 ℃左右，光照14 h，黑暗10 h,，萌发3~4周的烟草幼苗适用。

Trans5α、GV3101购自北京全式金生物技术有限公司；内切酶FastDigest Kpn I、FastDigest Xba I购自ThermoFisher Biotechnology Company。pTRV﹕RNA1质粒和pTRV﹕RNA2质粒由清华大学刘玉乐老师惠赠。

1.2 引物设计

应用Primier Quest Tool（http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index）软件对乙醛脱氢酶（ALDH）特异位点设计特异性荧光定量PCR引物。通过Blast program（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对所设计的引物序列与其它生物种属之间的同源性及其同源二聚体的有无。引物由上海博尚基因公司合成后对特异性进行筛选与评价。

1.3 VIGS载体的构建

选取NbALDH基因的全长cDNA序列信息设计引物，选取300 bp左右的序列，两端引入限制性内切酶Kpn I和Xba I的酶切位点。通过PCR反应扩增得到NbALDH基因片段。将此片段克隆到pTRV: RNA2载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，PCR验证并测序，测序正确，提质粒，并转入农杆菌GV3101。

1.4 VIGS实验

将上述携带3种质粒的农杆菌（pTRV1、pTRV2和pTRV2—ALDH）分别在28 ℃振荡培养过夜。4000 rpm离心5 min收集农杆菌，充分倒尽上清后，用农杆菌渗透液重悬细菌调整农杆菌悬浮液的OD600值为1.0左右，静置3~5 h后，将等体积的pTRV1农杆菌悬浮液和pTRV2－ALDH农杆菌悬浮液混合均匀后，开始注射本氏烟草叶片。所注射的本氏烟草为萌发3~4周的幼苗，具有4~6片真叶的茁壮生长的植株，用注射器将混合菌液通过压迫注射法接种烟草叶片。

1.5 RNA的提取，cDNA合成与纯度、浓度检测

在本氏烟接种TRV病毒后10 d，采用OMEGA植物RNA提取试剂盒进行本氏烟RNA提取，参照试剂盒说明书进行操作提取RNA。以RNA为模板，参照诺唯赞反转录试剂盒说明书，在冰上进行反转录实验，反应体系如下：4×gDNA wiper Mix 4 µL，模板RNA 1 µg，RNase free dd H2O to 16 µL，42 ℃ 2 min；在第一步反应管中直接加入5×Hi ScriptⅡq RT Super MixⅡ4 µL，第一步反应液16 µL；50 ℃ 15 min，85 ℃5 s。用分光光度计检测样品的浓度与纯度，并将cDNA的浓度稀释到0.1 μg·µl-1，-20 ℃保存。

1.6 荧光定量PCR标准曲线的建立

以稀释后的cDNA为模板，构建实时荧光定量PCR标准曲线，每个反应3次重复。反应体系为2*Super Real Pre Mix Plus 10 μL，上下游引物各0.4 L，cDNA模板4 μL，dd H2O补足至20 μL。以模板DNA浓度对数值为横坐标，反应循环数(Ct)值为纵坐标绘制标准曲线。

1.7 沉默乙醛脱氢酶的本氏烟瞬时表达RxLR129113

若验证在本氏烟上已经瞬时沉默了乙醛脱氢酶，将Rx LR129113，GFP，BAX分别在28 ℃振荡培养过夜。4000 rpm离心5 min收集农杆菌，充分倒尽上清液后，用农杆菌渗透液重悬细菌调整OD600值为0.5左右，静置3~5 h后，在本氏烟草叶片接种RxLR129113，24 h后接种BAX。

1.8 台盼蓝染色

配制台盼蓝染色液原液：取10 g苯酚、10m L乳酸、10m L甘油、10m L水和0.02 g台盼蓝混匀；配制水合氯醛脱色液：将1000 g水合氯醛溶于400 mL水中；先将配制好的台盼蓝原液加2倍体积的95%酒精稀释，取适量的染色液（根据叶片的多少而定）加到烧杯中，水浴预热1 min，加入接种的叶片，煮沸1~2 min，过夜放置；第2天将叶片转移到配好的水合氯醛脱色液中，反复更换水合氯醛脱色液数次，直到坏死部位呈蓝色，其他叶片组织呈透明色；将处理好的叶片放入95%酒精中，使叶片的对比度更加明显，并且使叶片变得结实，利于进一步的照相；将染色后的叶片照相，与未染色的叶片一一对应。

图 1 电泳检测接种pTRV1+pTRV2和pTRV2-ALDH本氏烟的RNA

2 结果与分析

2.1 RNA的提取

注射接种pTRV1和pTRV2－ALDH菌液10~14 d后，以pTRV1和pTRV2为对照，对叶片进行RNA的提取。提取RNA经紫外分光光度计检测，OD260/OD280 值均在1.9~2.0之间，说明所提取的总RNA纯度较高，OD260/OD230 值均在2.0左右，说明提取的RNA没有盐离子污染。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测显示28SrRNA、18SrRNA两条带清晰锐利(图1)，表明RNA未出现降解现象，符合进一步实验要求。

2.2 NbALDH基因沉默的荧光定量PCR结果

NbALDH在本氏烟中的表达量是相对于Nbactin的表达量而确定的。以接种pTRV1和pTRV2 的本氏烟作为对照，检测NbALDH的表达量。从图2-1，2-2的荧光定量PCR结果可以得出本氏烟的NbALDH基因沉默效率达70~80%，即沉默成功。

图 2-1 NbALDH荧光定量PCR扩增曲线

Fig.2-1 Real-time fluorescence quantitative standard curve of NbALDH

图 2-2 NbALDH荧光定量PCR表达模式分析

Fig.2-2 Real-time fluorescence expression patterns of NbALDH

2.3 沉默乙醛脱氢酶的本氏烟上瞬时表达RxLR129113能抑制BAX引起的细胞坏死

以GFP、Buffer作为对照在沉默乙醛脱氢酶本氏烟上瞬时表达RxLR129113，24 h后接种能够诱导细胞死亡的BAX，以接种pTRV1和pTRV2的本氏烟为对照。接种一周后观察RxLR129113能够抑制BAX引起的细胞死亡，实验结果如图3（左），3（右）。

图 3 RxLR129113分别在pTRV1+pTRV2（左）和沉默ALDH（右）本氏烟上抑制细胞死亡分析

Fig.3 Analysis of inhibition of cell death by effector RxLR129113 on pTRV1+pTRV2 (left) and silenced ALDH (right)

A：Rx LR129113+24 h BAX；B：GFP+24 h BAX；C：Buffer+24 h BAX，接种7 d后照相. 右图是台盼蓝染色结果

A: Rx LR129113+24 h BAX; B: GFP+24 h BAX; C: Buffer+24 h BAX, photographs was taken in 7 days post‐inoculation (dpi). Right photograph is the trypan blue staining result.

3 讨论

本研究采用的VIGS载体都是以天然植物病毒为基础的，某些VIGS载体就会有一些物种特异性的限制。迄今为止，烟草脆裂病毒载体是使用最广泛的VIGS载体，与其他病毒载体相比，TRV-VIGS载体具有插入目的基因长，诱导基因沉默效率高，持久性长，对宿主不会造成明显伤害等优点[12-13]，在烟草、拟南芥等多种植物上得到了广泛应用。本试验采用烟草脆裂病毒为载体，在本氏烟上沉默NbALDH，验证了RxLR129113仍然抑制BAX引起的坏死。由此说明，RxLR129113与互作蛋白ALDH互作并不影响对BAX的抑制，可以继续在本氏烟上沉默NbALDH验证RxLR129113的其它功能是否发生变化，为进一步研究RxLR129113与互作蛋白ALDH互作机制奠定了基础。

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Effect of Transient Silencing of Acetaldehyde Dehydrogenase on the Function ofRxLR129113

WANG Li-ying1, LIANG Tao1, ZHU Tong-tong2, MA Yan-fei2, JIANG Wei-lin2, Ji Rui-qing1, ZHANG Xiu-guo2*

1.130118,2.271018,

One of the functions of theeffector RxLR129113 onis to inhibit BAX-induced cell necrosis, and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) has been shown to be an interaction protein of RxLR129113. To investigate whether aldehyde dehydrogenase (ALDH) affects RxLR129113 inhibition of BAX-induced cell necrosis, this study cloned the aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene fragment and inserted it into tobacco using virus-induced gene silencing (VIGS) technology. In the fragile virus vector (TRV), the VIGS vector of pTRV-ALDH was constructed, and the ALDH gene was successfully silenced by qrt-PCR after agrobacterium infecting. RxLR129113 was transiently expressed onwith silenced ALDH gene, and BAX was inoculated 24 h. The results showed that RxLR 129113 still inhibited BAX-induced cell necrosis on NbALDH-silenced plants. The results of this study indicate that the interaction between RxLR129113 and ALDH does not affect the inhibition of BAX-induced cell necrosis, which lays a foundation for further research on the functional mechanism ofeffector RxLR129113.

; real-time fluorescent quantitative PCR; gene silencing (VIGS) technology; expression

S436.418.1+2

A

1000-2324(2019)01-0031-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.006

2018-04-23

2018-06-02

国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-03B)

王俪颖(1993-),女,在读硕士研究生.研究方向:植物病原真菌学和真菌资源利用. E-mail:1479779905@qq.com

Author for correspondence. E-mail:jiruiqingjrq@126.com; Zhxg@sdau.edu.cn