槲皮素通过影响TRAF6/TAK1信号通路改善脂多糖诱导的BV-2细胞炎性损伤

沈先敏，刘 恒

0 引言

帕金森综合征(Parkinson′s disease，PD)属于一种中枢神经系统退行性病变，患者主要集中于老年人群，然而其发病机制仍未得到完全阐明[1]。早期有研究提出帕金森综合征患者脑脊液中炎性因子水平显著升高，会进一步反馈诱导小神经胶质细胞的过度活化而聚集成团[2-3]。研究证实，脂多糖、淀粉样蛋白(Aβ)及细胞因子均能够过度激活小神经胶质细胞[4-5]，活化的小胶质细胞会进一步发生形态营养不良及凋亡，导致多种退行性疾病的发生发展[6]。有报道，慢性神经炎症是导致帕金森综合征发生与发展的重要病因，并且激活的小胶质细胞会产生多种炎性因子，损伤周围的神经元细胞[7]。槲皮素(Quercetin)主要存在于中草药及蔬果中，属于天然黄酮类活性物质，在抗炎、抗氧化、抗癌等方面效果显著，对神经元还发挥着类似神经营养因子的作用[8]。近期研究发现，槲皮素对急性缺血性卒中大鼠具有保护作用，其机制可能与抑制TRAF6/IKKβ/NF-κB信号通路有关[9]。有报道，槲皮素对原代皮层神经元细胞氧糖剥夺损伤具有较好的保护作用，其作用机制可能与抑制Traf6/TAK1信号通路活化有关[10]。因此，笔者研究了槲皮素对BV-2细胞炎症反应的影响，并探讨槲皮素对介导炎症反应TRAF6/TAK1信号通路活化的影响，以期为神经退行性疾病的治疗奠定理论基础。

1 材料及方法

1.1 材料及试剂 槲皮素(成都普瑞法科技开发有限公司，批号：1257-08-5，纯度≥98%)；小鼠小胶质瘤BV-2细胞由武汉巴菲尔生物有限公司提供(来源于美国ATCC细胞库)；DMEM培养基及胎牛血清均购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Thermo scientific公司(批号：R001100)；CCK8试剂盒购自北京智杰方远科技有限公司(批号：CK04)；LPS(批号：L2880，Sigma公司)；IL-6、IL-1β及TNF-α ELISA试剂盒购自武汉华美生物有限公司(批号分别为WK15204、WK25540、WK36640)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自武汉谷歌生物有限公司(批号：P57460)；兔抗鼠β-actin(货号：ab108267)、iNOS(货号：ab152104)、COX-2(货号：ab105217)、TRAF6(货号:ab1214527)、TAK1(货号:ab115200)及p-TAK1(货号:ab1652540)一抗均购自英国Abcam公司；HRP标记山羊抗兔IgG二抗购自武汉谷歌生物有限公司。

1.2 仪器 BIORAD-550型酶标仪(美国伯乐公司)；BBS-V800型单人超净台(山东鑫贝西公司)；SPX-250型细胞培养箱(美国Thermo公司)；GE-100型凝胶电泳仪(北京六一仪器厂)；双色红外激光成像系统(BIO-RAD，美国)。

1.3 BV-2细胞培养 采用DMEM完全培养基培养，培养箱条件为37 ℃、5%CO2浓度，待细胞长满至95%左右时，用PBS清洗后加入胰酶消化，显微镜下观察，待细胞变圆后加入培养基终止消化，分装于3个培养瓶进行传代培养。

1.4 槲皮素对BV-2细胞增殖的影响 取对数生长期细胞消化、离心、重悬后，以1×105个/ml的细胞浓度接种于96孔板，每孔加入200 μl的细胞悬液，每组设置5个复孔。细胞培养过夜后用于后续实验，实验分为5组：正常对照组、LPS(1 mg/L)诱导组、LPS+低剂量(75 μmol/L)槲皮素组、LPS+中剂量(150 μmol/L)槲皮素组、LPS+高剂量(300 μmol/L)槲皮素组，首先在药物组中加入相应浓度槲皮素溶液，2 h后再加入LPS溶液。培养24 h，吸去旧培养液，每孔加入10 μl CCK8试剂，孵育1 h后采用酶标仪450 nm波长下OD值。实验重复3次，计算细胞相对存活率。

1.5 ELISA实验 将对数生长期细胞进行消化重悬接种于6孔板，待细胞贴壁后吸去旧培养基，按“1.4”项分组及药物处理24 h后收集细胞及细胞上清，细胞上清用于炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平检测，其操作步骤严格按照说明书进行。

1.6 Western blot 将“1.5”项收集的细胞裂解制备成匀浆，离心收集上清提取细胞蛋白，BCA法测定细胞总蛋白浓度。各孔取50 μg的蛋白上样，用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，将分离后的蛋白电转移至NC膜。加入5%脱脂奶粉封闭液于摇床上室温封闭1 h后，分别加入iNOS、COX-2、TRAF6、TAK1、p-TAK1抗体(体积稀释比例均为1∶1 000)4 ℃反应过夜。次日以TBST洗膜3次后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(体积稀释比例为1∶3 000)，室温反应1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL试剂显影后进行蛋白条带灰度值分析。

2 结果

2.1 不同组间细胞相对存活率比较 槲皮素对BV-2细胞增殖的影响见图1。与正常对照组比较，LPS诱导组中细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)；与LPS诱导组比较，各剂量槲皮素组细胞相对存活率明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，并且随着槲皮素剂量的增加，细胞相对存活率增高，呈现出浓度依赖性。

图1 槲皮素对BV-2细胞相对存活率的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05;与LPS诱导组比较，#P<0.05。1.正常对照组；2.LPS诱导组；3.LPS+低剂量槲皮素组；4.LPS+中剂量槲皮素组；5.LPS+高剂量槲皮素组

2.2 槲皮素对BV-2细胞分泌炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平的影响 与正常对照组比较，LPS诱导组中细胞上清炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平明显升高(P<0.05)；与LPS诱导组比较，各剂量槲皮素组细胞上清炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，并且随着槲皮素剂量的增加，细胞上清炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平降低，表现出浓度依赖性。见表1。

表1 槲皮素对BV-2细胞上清炎性因子水平的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05;与LPS诱导组比较，#P<0.05

2.3 槲皮素对BV-2细胞中iNOS和COX-2蛋白表达水平的影响 与正常对照组比较，LPS诱导组中iNOS和COX-2蛋白的表达水平明显升高(P<0.05)；与LPS诱导组比较，各剂量槲皮素组细胞iNOS和COX-2蛋白的表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，并且随着槲皮素剂量的增加，细胞iNOS和COX-2蛋白的表达水平降低，表现出浓度依赖性。见图2。

2.4 槲皮素对BV-2细胞中TRAF6/TAK1信号通路的影响 与正常对照组比较，LPS诱导组细胞中TRAF6及p-TAK1表达水平明显增高(P<0.05)；与LPS诱导组比较，各剂量槲皮素组细胞中TRAF6及p-TAK1表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，并且随着槲皮素剂量的增加，细胞中TRAF6及p-TAK1表达水平降低，表现出浓度依赖性。见图3。

3 结论

帕金森综合征的病原学仍处于探索阶段，前期学者们提出Aβ及TAU蛋白过度磷酸化与该病的发生发展密切相关，还提出神经炎性反应也是导致该疾病发生的最主要原因之一[11]。小神经胶质细胞表现出免疫调节作用，当其被活化时便具有正负双向调节作用，包括吞噬Aβ、降低斑块的沉积，激活炎性通路、诱导炎性因子释放[12]。因此，降低神经系统炎性反应是预防帕金森综合征发生的主要措施之一。槲皮素属于一种天然黄酮类活性物质，并且黄酮类化合物能够改善炎症因子引起的神经元细胞的炎性损伤，提示其在预防及治疗神经退行性疾病中有着较好的药理作用[13]。国内外关于槲皮素在神经退行性疾病中保护作用的研究较少，有关研究证实槲皮素通过抑制Aβ分泌酶及诱导Aβ消化酶表达起到保护Aβ诱导的BV-2细胞损伤的作用[14]。该研究探讨了槲皮素对LPS诱导BV-2细胞炎性损伤的保护作用，初步研究了槲皮素保护BV-2细胞免受炎性损伤的效果与机制。San等[15]研究槲皮素作用BV-2细胞的药物浓度，采用CCK8预实验，筛选出本研究中低、中、高3种剂量的药物浓度。实验结果发现，槲皮素能够降低LPS诱导的BV-2细胞炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α的释放，还能抑制炎性蛋白iNOS和COX-2的表达，改善炎性损伤，进一步诱导细胞增殖。

图2 不同组间炎性蛋白表达比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05;与LPS诱导组比较，#P<0.05。1.正常对照组；2.LPS诱导组；3.LPS+低剂量槲皮素组；4.LPS+中剂量槲皮素组；5.LPS+高剂量槲皮素组

图3 不同组间TRAF6及p-TAK1蛋白表达比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05;与LPS诱导组比较，#P<0.05。1.正常对照组；2.LPS诱导组；3.LPS+低剂量槲皮素组；4.LPS+中剂量槲皮素组；5.LPS+高剂量槲皮素组

肿瘤坏死因子相关受体因子6(TRAF6)属于一种衔接蛋白，在胞外各种因素刺激下，膜受体激活启动TRAF6的活化，后者将会激活转录生长因子-β活化激酶1(TAK1)的磷酸化，将胞外信号传导至胞内诱导炎性通路的活化[16]。动物学实验发现，在小鼠体内过表达TARF6基因，会引起TAK1磷酸化水平的增高，继而活化NF-κB信号通路，导致细胞炎症反应、氧化损伤及细胞凋亡的发生[17]。体外采用LPS诱导BV-2细胞炎性损伤模型，发现五味子甲素能够通过抑制TRAF6-IKK8-NF-κB信号通路的活化，诱导神经炎性相关蛋白iNOS及COX-2蛋白的表达，从而降低BV-2细胞的炎性损伤[18]。本实验证实，LPS能够引起TRAF6/TAK1信号通路的活化，进一步诱导相关蛋白iNOS及COX-2的表达，导致BV-2细胞炎性损伤的出现。对细胞进行不同剂量槲皮素处理后，能够明显抑制TRAF6及p-TAK1蛋白的表达，降低TRAF6/TAK1信号通路的活化程度，进一步抑制iNOS及COX-2的表达。不仅如此，LPS还能诱导BV-2细胞存活率的降低，而槲皮素能够诱导BV-2的增殖，还能降低炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α的产生。总之，本研究结果表明，槲皮素能显著降低LPS引发的BV-2细胞炎性损伤，降低炎性相关蛋白的表达，其作用机制可能与抑制TRAF6/TAK1信号通路活化有关。