超滤-纳滤联合用于川贝母生物碱的浓缩工艺

骆灵敏，郑敏霞

0 引言

川贝母(FritillariaeCirrhosaeBulbus)来源于百合科(Liliaceae)植物贝母属(FritillariesL.)中多种植物的鳞茎，经晒干或低温干燥制得[1]。川贝母性苦、甘，微寒，归肺、心经，用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、咳痰带血等[2]，是四川最具代表性的道地药材之一[3]。川贝母中的主要活性组分为生物碱，包括西贝母碱、川贝碱和西贝素等等[4-6]。目前已见报道的川贝母生物碱类活性成分的提取方法主要有乙醇渗滤法[7]、氨水浸提法[8]、酸水浸提法[9]等，虽然提取过程有效提高了川贝母生物碱的提取效率，但是由于西贝母碱不耐光热，在浓缩和干燥过程中，均出现了含量下降的问题。膜分离技术在制药行业中应用日趋广泛，其中纳滤技术具有无热效应、能耗低等优点[10-11]，超滤可以选择性地去除大分子杂质，有效保留小分子目标成分。以上两种膜组件串联在中药行业中的应用尚处于摸索阶段[12]。本文采用响应面法，以西贝母碱为研究指标，探讨了超滤-纳滤联用优化川贝母生物碱的纳滤浓缩参数，建立了含有热敏性小分子活性组分的中药浓缩范例。

1 仪器与材料

TU-1901型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。聚醚砜纳滤膜，截留相对分子量100、500、1 000，购自杭州科百特过滤器材有限公司；聚偏氟乙烯超滤膜，截留相对分子质量10 000、50 000、100 000，购自杭州科百特过滤器材有限公司。

川贝母饮片购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，并经朱涛副主任中药师进行生药学鉴定。西贝母碱对照品(批号：110767-201710)购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯(Tedia公司)，溴化钾为光谱纯(国药集团化学试剂有限公司)，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯(浙江三鹰化学试剂有限公司)。

2 方法

2.1 川贝母提取液制备[13]取川贝母药材20 g，加入14倍量(重量/体积)65%乙醇渗滤7 h，渗滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2 考察指标的检测

2.2.1 西贝母碱[1]标准曲线的制备：取西贝母碱对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每l ml含0.2 mg的对照品溶液。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 ml，分别加三氯甲烷至10.0 ml、水5 ml、0.05%溴甲酚绿缓冲液2 ml，振摇，放置分层。取三氯甲烷液，过滤，取续滤液在415 nm的波长处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标、浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：A=0.036 90 C-0.022 75，R2=0.994 7(n=5)，结果表明，西贝母碱质量浓度在2.0～20.0 μg/ml范围内吸光度呈良好的线性关系。

样品测定：取“2.1”项下提取液稀释一定倍数，加浓氨试液3 ml，浸润1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液(以下简称“混合溶液”)40 ml，80 ℃水浴回流2 h，滤过，滤液加混合溶液定容至50 ml，摇匀。精密量取2～5 ml，于水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 ml使溶解，照上述方法，测定吸光度计算，即得。

2.2.2 总蛋白[14]按BCA蛋白质浓度测定法，使用相关试剂盒测定供试样品中蛋白质浓度。

2.3 超滤去除大分子 为达到提高纳滤分离的效率、降低膜过滤系统的污染等目的，我们采用超滤法去除川贝母提取液中的蛋白质等大分子。取“2.1”项下的川贝母提取液，分别依次通过截留相对分子量为100 000、50 000、10 000的超滤膜，以西贝母碱和总蛋白质含量的动态变化情况为评价指标，对超滤过程的工艺参数进行筛选。

2.4 纳滤分离单因素考察 参照川贝母生物碱分子量等相关参数，我们选择截留相对分子量为450的纳滤膜进行单因素考察及后续研究。取川贝母超滤液(1 L)置于纳滤装置中循环一定体积后，进行纳滤，待纳滤过程完成后，即得纳滤液。

为了考察膜吸附对于川贝母中西贝母碱等生物碱类成分是否会产生破坏，同时确定纳滤工艺参数，以西贝母碱含量变化情况为评价指标，选择药液循环体积、溶液温度、纳滤压力3个关键因素进行单因素考察，具体参数见表1。

表1 单因素考察参数

2.5 透过率和截留率计算 分别精密吸取纳滤(或超滤)工艺中的平衡液、纳滤液(或超滤液)，按“2.2”项下的测定方法，测定待测成分的浓度，透过率(T)、截留率(R)计算公式为：T=C1/C2×100%，R=(1-C1/C2)×100%，其中，C1为纳滤液(或超滤液)中待测成分的质量浓度，C2为平衡液中待测成分的质量浓度。

2.6 Box-Behnken响应面法试验设计 在纳滤工艺参数单因素考察的基础上，使用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken响应面法试验的设计及结果分析。我们选择在纳滤膜分离纯化过程中，对结果影响最关键的3个因素：纳滤膜截留相对分子量、西贝母碱浓度、溶液pH值作为响应面实验的自变量，分别以-1、0、1代表自变量的变化水平，试验因素水平表见表2。

表2 纳滤浓缩响应面法考察因素水平表

3 结果

3.1 超滤大分子去除结果 不同截留相对分子量滤膜对川贝母提取液中生物碱类成分和蛋白质类成分的分离情况见表3。

表3 不同截留相对分子量的超滤膜对生物碱类成分和蛋白质类成分的分离情况

西贝母碱的相对分子量为429.6，在所有超滤分离试验中的透过率均达到98%以上，几乎没有损失。总蛋白的透过率结果说明，超滤技术可有效去除川贝母提取液中的蛋白质类成分，当使用截留相对分子量为10 000的超滤膜时，几乎可以将提取液中的蛋白质类成分全部去除；但去除的效果随着截留相对分子量的增大逐步下降。出于保留川贝母提取液中有效成分和去除大分子物质两者综合考虑，我们选择截留相对分子量为10 000的超滤膜，用于超滤分离过程。

3.2 纳滤单因素考察结果

3.2.1 药液循环体积考察 在进行纳滤浓缩时，部分西贝母碱会吸附在纳滤膜表面，同时已经吸附的成分会从纳滤膜上解吸附下来，随着药液和纳滤膜接触的增加，吸附和解吸附速率逐渐相等，达到平衡。药液循环体积因素考察结果见表4，可知纳滤膜对西贝母碱的透过率产生了明显的吸附作用，随着循环体积的不断增加，西贝母碱的透过率逐渐降低，当循环体积为4 L时，透过率趋于稳定，说明此时吸附速率和解吸附速率相同，达到平衡状态。

表4 药液循环体积对西贝母碱截留率的影响

3.2.2 溶液温度考察 根据纳滤膜供应商提供的滤膜参数，结合川贝母中生物碱的稳定性情况，纳滤时的最高溶液温度应小于50 ℃，考察结果见表5。可知随溶液温度的上升，西贝母碱的截留率显著下降，同时可观察到膜通量相应增加。其中，5 ℃时纳滤膜对生物碱类成分的截留率最高，20 ℃时截留率略微下降，但与5 ℃结果比较差异无统计学意义。据结果推测，随着溶液温度的上升，上述有效成分在纳滤膜中的扩散系数增大，扩散加剧，从而更易通过纳滤膜，使截留率下降。

表5 溶液温度对西贝母碱截留率的影响

3.2.3 操作压力考察 操作压力直接影响纳滤浓缩的效率，操作压力越高，膜通量越大。操作压力考察结果见表6。随着操作压力的升高，西贝母碱的截留率呈现出一定程度的升高，当操作压力为1.5 MPa时，截留率最高。

表6 操作温度对西贝母碱截留率的影响

3.3 响应面法优化纳滤工艺参数 在单因素试验结果基础上，我们选择的循环体积为8 L、溶液温度为20 ℃、操作压力为1.0 MPa，充分发挥纳滤系统的浓缩能力，提高实验结果的准确；每组试验平行进行3次，用截留率的平均值进行后续分析，确保试验的稳定性。试验设计及结果见表7，方差分析结果见表8。

表7 纳滤浓缩过程的响应面设计结果

表8 纳滤浓缩过程响应曲面二次回归模型的方差分析

3.3.1 模型方程建立与显著性检验 使用Design-Expert 8.0.6软件进行实验结果拟合分析，得到西贝母碱对上述3个自变量的二元回归方程：西贝母碱截留率Y=92.52+6.73A+12.86B+6.79C+3.5AB-0.17AC+2.25BC-6.29A2-19.27B2-13.7C2。由该模型的方差分析可知，F值为43.49，P<0.000 1，说明该模型显著；3个自变量对西贝母碱的截留结果影响的顺序为B>C≈A，相关系数R2=0.982 4，预测R2=0.967 8，调整R2=0.979 8，说明模型的拟合结果理想。综上所述，该模型十分显著，可有效进行响应值的预测，实验设计方案科学合理。

3.3.2 纳滤过程条件的响应面分析与优化 用“3.3.1”项下的回归方程作图，得到图1。由图1可知，3个自变量对于西贝母碱的截留情况均有不同程度的影响，其中对于截留情况影响最大的是超滤液浓度。随着药液浓度的升高，西贝母碱的截留率先提高，达到最高点后开始下降，对应的响应曲面斜率变化最大，说明在纳滤浓缩过程中，西贝母碱浓度的影响占主导地位。pH值对截留情况具有一定程度的影响，当超滤液pH值从碱性变为酸性，生物碱类活性成分逐渐离子化成为盐，由于纳滤膜荷负电，生物碱类成分的阳离子盐因为静电引力更难通过纳滤膜的孔隙[15-16]，使截留率提高；但过低的pH值会影响滤膜的稳定性，从而使截留率降低。纳滤膜孔径对于截留情况具有一定程度的影响，响应曲面较为平缓。虽然纳滤膜截留相对分子量跨度较大(100～1 000)，但是由于超滤液浓度及pH值的影响，使西贝母碱难于通过纳滤膜，部分抵消了纳滤膜孔径变化对截留率的影响。

根据Design-Expert 8.0.6软件对结果的优化分析，通过提高截留率来提高膜分离效果，得到的西贝母碱纳滤工艺最优工艺参数为：截留相对分子量为710、西贝母碱质量浓度为243 μg/ml、超滤液pH为5.3；西贝母碱的截留率预测值为93.80%。考虑到实际操作的简便性和可行性，对上述参数进行调整，选定的最佳参数为截留相对分子量为500、西贝母碱质量浓度为140 μg/ml、超滤液pH为5.5。

以最优工艺参数为基础，进行验证试验，西贝母碱实际截留率为93.57%(n=3)，相对偏差为0.25%，说明预测结果和实测结果间偏差小，模型的预测结果准确可信。

4 讨论

加热浓缩是中药制剂浓缩最常用的技术手段，唐代即有关于煎煮浓缩的记载，具有简便易行、设备要求低、技术成熟等优点。但加热浓缩过程因条件较为剧烈，常出现氧化、聚合及美拉德反应，使部分热敏性及稳定性差的活性成分遭到破坏，一定程度上限制了加热浓缩手段的应用；此外，加热浓缩能源消耗大，能源利用效率低，不符合国家绿色化学、绿色工业的倡议。超滤过程不产生热量，浓缩效率高，能源利用效率高，很好地解决上述问题，特别适用于以西贝母碱为代表的生物碱类活性成分(生物碱类成分通常稳定性较差)的浓缩，为此类成分的浓缩提供了一种全新的技术路径。

图1 截留相对分子量、西贝母碱质量浓度及pH对西贝母碱纳滤结果的影响

随着全新功能型新材料的开发，滤膜在强度、化学成分定性及孔径的可控性方面有了显著的提升，膜分离技术也日益成熟，受到学界的关注。膜分离技术具备分离参数易控、重现性好、易于工业端的放大转化等优点，具有良好的产业化基础。虽然以聚四氟乙烯滤膜为代表的新型滤膜的应用已非常成熟，但由于其造价高、应用与水相系统前需要用异丙醇浸润，在增加了分离成本的同时，也存在引入污染物的风险。因此,在进行膜分离研究时，需要充分、全面地评估待分离组分，对体系内各组分的化学特性进行充分的评估，以选择适宜材质的滤膜。