飞龙九一巴布贴抗炎、镇痛药效学及其对膝骨关节炎滑膜炎影响的研究

苏友新 黄露露 赖兴泉 朱亚菊 李保林 王建辉 滕方舟

【摘 要】目的：明确飞龙九一巴布贴的抗炎镇痛效果及其对膝骨关节炎滑膜炎的疗效。方法：采用角叉菜胶致大鼠足趾肿胀炎症模型，热板致小鼠舔足、冰醋酸致小鼠扭体2个疼痛模型及木瓜蛋白酶致新西兰大白兔膝骨关节炎滑膜炎模型等，观察飞龙九一巴布贴对大鼠足趾肿胀度、小鼠痛阈值、扭体次数、兔关节表面温度、关节周径、改良Lequesne MG得分及滑膜组织形态学等指标的影响。结果：①抗炎镇痛药效方面，与致炎组及致痛组比较，巴布贴组可显著降低大鼠足趾肿胀程度，提高小鼠痛阈值，减少小鼠扭体反应次数（P < 0.01）。在大鼠足肿胀实验中，致炎后0～2 h，巴布贴组对肿胀抑制作用弱于双氯芬酸二乙胺乳胶剂组（扶他林组）（P < 0.05）;致炎后2～8 h，巴布贴组比扶他林组对肿胀的抑制作用更强（P < 0.05）。在小鼠热板法实验中，末次给药干预后0～1 h，巴布贴组对小鼠痛阈值的提高作用弱于扶他林组（P < 0.05）;末次給药干预后1～3 h，巴布贴组比扶他林组对小鼠痛阈值的提高更显著（P < 0.05）。在小鼠扭体实验中，巴布贴组与扶他林组减少小鼠扭体次数的作用相当（P > 0.05）。②对膝骨关节炎滑膜炎影响方面，与空白组比较，模型组膝关节表面温度、关节周径、改良Lequesne MG得分显著升高（P < 0.01）;与模型组比较，巴布贴组各指标均显著降低（P < 0.01），且滑膜炎症细胞浸润得到明显改善;与扶他林组比较，各指标差异均无统计学意义（P > 0.05）。结论：飞龙九一巴布贴抗炎镇痛作用显著，对膝骨关节炎滑膜炎亦有显著抑制作用。

【关键词】 骨关节炎，膝;滑膜炎;飞龙九一巴布贴;抗炎;镇痛;小鼠;大鼠;兔

巴布剂在2010年版《中国药典》中又称为凝胶剂，是药物与亲水性基质均匀混合后涂布于背衬材料制成的贴膏剂[1]。作为一种新型外用剂型，巴布贴剂易携带，成本低，载药量大，可反复使用，与皮肤相容性好，过敏反应少，不易污染衣物[2-5]。因此，该制剂自20世纪70年代问世以来，已被广泛接受且运用于膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）等多种疾病的治疗[6-8]。

飞龙九一巴布贴是在笔者运用中草药熏洗治疗骨关节炎（osteoarthritis，OA）引起的关节肌肉疼痛、肿胀的基础上，与台湾旺腾草本药学国际有限公司合作研制而成。该贴剂由闽台特色的药食两用草本植物飞龙掌血、九节茶（草珊瑚）、阔叶大豆（一条根、千斤拔）等制成，具有温经通络、祛风除湿、消肿止痛之功效。前期已在台湾制成“一般保养品”试用，显示其对缓解KOA引起的关节、肌肉酸痛肿胀等效果显著;但由于缺乏该贴剂抗炎镇痛等药效的基础研究数据，影响了其推广应用。研究表明，滑膜炎与KOA的发生发展具有密切关系，并伴随本病的整个周期[9]，为KOA发病的核心病理之一。飞龙九一巴布贴对KOA的治疗作用是否与其抑制滑膜炎有关，值得进一步研究。本研究通过观察飞龙九一巴布贴抗炎、镇痛药效学及其对KOA滑膜炎的影响，以明确该贴剂抗炎镇痛效果及其对KOA滑膜炎的疗效，为其进一步临床推广应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 1月龄SPF级昆明种小鼠（KM小鼠）60只，雌雄各半，体质量18～22 g;3月龄SPF级Wistar雄性大鼠30只，体质量200～220 g;3月龄清洁级新西兰大白兔24只，雌雄各半，体质量1.8～2.3 kg。所有动物均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK（沪）2012-0002（KM小鼠、Wistar大鼠），SCXK（沪）2012-0011（新西兰大白兔）。委托福建中医药大学实验动物中心代购并饲养，实验动物使用许可证号SYXK（闽）2014-0006，饲养条件为室温（24±2）℃，相对湿度45%～55%，光暗周期12 h/12 h。适应性喂养1周后进行实验。

1.2 实验药物 双氯芬酸二乙胺乳胶剂（北京诺华制药有限公司，生产批号VP1027）;飞龙九一巴布贴（台湾旺腾草本药学国际有限公司，生产批号2016122703，规格10 cm×15 cm）。

1.3 主要试剂 冰醋酸、硫化钠（西陇科学股份有限公司，生产批号1706251，1608022）;水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，生产批号20160509）;Carrageenan（美国SIGMA公司，生产批号SLBK3896V）;木瓜蛋白酶（美国SIGMA公司，生产批号SLBR9817V）;L-半胱氨酸（美国MERK公司，生产批号MB4037）。

1.4 主要仪器 智能热板仪（成都泰盟软件有限公司，型号RB-200）;万分之一电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司，型号FA604A）;足趾容积测量仪（安徽正华生物仪器设备有限公司，型号ZH-YLS-7B）;红外体温探测仪（深圳市特思高电子有限公司，型号HT-F03B）。

2 方 法

2.1 抗炎、镇痛药效学实验

2.1.1 大鼠足趾肿胀实验 取30只雄性Wistar大鼠，在背部脱除面积为3 cm×3.3 cm的毛发（用牙刷将质量分数为10 %的硫化钠溶液均匀地涂刷在背部毛上，待鼠毛呈黄色黏液状时，用清水洗净，纱布擦干，2 d后进行实验），随机分为单纯致炎组（致炎组）、飞龙九一巴布贴组（巴布贴组）、双氯芬酸二乙胺乳胶剂组（扶他林组），每组10只。

致炎组常规饲养，不做给药干预;巴布贴组按20 cm2·kg-1剂量巴布贴贴于脱毛的背部皮肤，每次敷贴4 h;扶他林组按0.35 g·kg-1剂量双氯芬酸二乙胺乳胶剂均匀涂抹于相同区域。于每日8∶00与14∶00各干预1次，连续7 d。随后采用足趾容积测量仪测量各组大鼠右后足容积（将大鼠右足与小腿固定呈90°后在足跟上10 mm的踝关节处用记号笔画一横线，再将该线以下的足趾垂直伸入测量仪中，使该线与液面平齐后读取数值），反复3次取平均值。末次干预后30 min进行致炎造模，对每只大鼠右后足底2，3跖骨间皮下注射质量分数为1%的角叉菜胶0.1 mL，并于致炎后0.5，1，2，3，4，6，8 h依次测量各鼠右后足容积，反复3次取平均值，并计算足趾肿胀度。肿胀度 = 致炎后大鼠足容积-致炎前大鼠足容积。

2.1.2 小鼠热板法实验 取30只雌性KM小鼠，背部脱毛（方法同2.1.1，面积为2 cm×2 cm），将小鼠依次放入预热至（55±0.5）℃的热板测痛仪内。小鼠从放在热板上至第1次出现舔后足所需时间，即为该鼠的干预前痛阈值。实验过程中若出现小鼠第1次舔后足时间 < 5 s或 > 30 s或跳跃者则弃之不用。将筛选合格的30只小鼠随机分为单纯致痛组（致痛组）、巴布贴组、扶他林组，每组10只，干预方法同2.1.1，巴布贴组按39 cm2·kg-1剂量巴布贴贴于脱毛的背部皮肤，每次敷贴4 h;扶他林组按0.5 g·kg-1剂量双氯芬酸二乙胺乳胶剂均匀涂抹相同区域，以上2组分别于每日8∶00与14∶00各干预1次，连续干预3 d。所有小鼠均在末次干预后0.5，1，1.5，2，3 h测量痛阈值，统计并计算干预前后的痛阈提高值及痛阈提高百分率，分析比较药物对物理致痛的镇痛效果。

2.1.3 小鼠扭体实验 取30只雄性KM小鼠，脱毛、分组及干预方法同2.1.2。末次干预后30 min，各组小鼠腹腔注射质量分数为0.6%的醋酸溶液（每只0.2 mL）。观察并记录注射后20 min内小鼠出现扭体反应的次数，统计干预后各组镇痛率，分析比较药物对化学致痛的镇痛效果。镇痛率 = （致痛组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/致痛组平均扭体次数×100%。

2.2 兔KOA滑膜炎模型实验 取24只新西兰大白兔，随机抽取6只作为空白组，其他作为造模组。造模组分别于实验第1，4，7天，左侧膝关节腔注射0.3 mL质量分数为2%的木瓜蛋白酶与浓度为0.03 mol·L-1的L-半胱氨酸溶液的混合液（按2∶1比例混匀），建立KOA滑膜炎模型[10]。

造模第14天进行模型鉴定[11-12]，将造模成功的18只新西兰大白兔随机分为模型组、巴布贴组、扶他林组，每组6只。并于实验第15天在（24±2）℃的室温下，采用非接触红外线皮温计测定兔左膝关节皮肤温度（将非接触红外线皮温计探头中心对准兔左膝关节髌上囊剃毛肿胀处、距离皮肤约1 cm位置，重复测量3次取平均值）;以皮尺测量兔左膝关节周径（用皮尺沿兔左膝关节髌底环绕1周以测量兔左膝关节周徑）;对兔左膝关节进行改良Lequesne MG得分评估[13]（运用改良Lequesne MG得分评估方法进行行为学评估，内容包括局部疼痛刺激、步态、关节活动、关节肿胀4个方面，共计11分，得分越高表明症状越严重）。接着将各组兔左膝关节髌上囊干预部剃除毛发，面积为5 cm×10 cm。再予相应药物干预，巴布贴组按21 cm2·kg-1剂量巴布贴敷贴于膝关节髌上囊剃毛区域，每次敷贴4 h;扶他林组按0.72 g·kg-1剂量双氯芬酸二乙胺乳胶剂均匀涂抹于相同部位;上述2组兔于每日8∶00干预1次，连续14 d，并于末次干预结束后再次测量上述3个指标。空白组及模型组不予给药干预，但同时测量上述指标。并对各组兔左膝关节做滑膜病理切片与HE染色（在末次干预结束后对各组兔予空气栓塞法处死，取下左膝关节滑膜组织，按脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、裱片、烘烤、HE染色、镜下观察等顺序进行HE染色形态学观察）。

2.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，重复测量资料比较采用两因素重复测量方差分析，各时间点组间比较采用多变量方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀度的影响 与致炎组比较，巴布贴组、扶他林组在角叉菜胶致炎后各时间点足肿胀度比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）。致炎后0～2 h，巴布贴组对肿胀抑制作用稍弱于扶他林组（P < 0.05）;致炎后2～8 h，巴布贴组足趾肿胀度持续呈现降幅（P < 0.05）。而扶他林组在2～4 h仍呈现升幅，4～8 h呈现降幅，提示该时间段巴布贴组较扶他林组对肿胀的抑制作用较强。见表1。

3.2 对热板法物理致痛的影响 与致痛组比较，巴布贴组、扶他林组末次给药干预后各时间点均能显著提高小鼠痛阈值（P < 0.01）。末次给药干预后1 h内，巴布贴组对小鼠痛阈值的提高作用弱于扶他林组（P < 0.05）。末次给药干预后1～3 h，巴布贴组小鼠痛阈值呈现持续升幅（P < 0.05），而扶他林组呈现降幅，提示该时间段巴布贴组比扶他林组对小鼠痛阈值的提高更显著。见表2。

3.3 对兔KOA滑膜炎模型关节滑膜形态学的影响 普通光镜下显示，空白组滑膜细胞约1～2层，呈扁平整齐分布，见大量脂肪细胞，未见炎症细胞及小血管;模型组滑膜细胞层数明显增加，达8～10层，伴有炎症细胞浸润、血管扩张与充血;扶他林组及巴布贴组滑膜组织增生，达4～5层，有少量炎性细胞浸润，间质纤维组织增生。

3.4 对兔KOA滑膜炎模型膝关节皮肤温度、关节周径及Lequesne MG得分的影响 与干预前比较，巴布贴组、扶他林组干预后膝关节皮肤温度、膝关节周径及Lequesne MG得分显著降低（P < 0.01）;干预后，巴布贴组、扶他林组均低于模型组（P < 0.01）;而巴布贴组与扶他林组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3.5 对冰醋酸致小鼠扭体的影响 与致痛组比较，巴布贴组、扶他林组扭体次数均显著减少（P < 0.01）;2组镇痛率分别为72.54%、75.13%，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

4 讨 论

本研究结果表明，飞龙九一巴布贴均可显著降低角叉菜胶致大鼠足肿胀程度，明显减少小鼠扭体反应次数、提高小鼠痛阈值。此外，还能显著减轻KOA滑膜炎兔模型的关节肿胀，降低关节皮肤温度及改良Lequesne MG得分，且可使滑膜炎症细胞浸润得到明显改善。以上结果提示，飞龙九一巴布贴具有抗炎镇痛作用，对KOA滑膜炎也可发挥较好的抑制作用，且药效持久。值得一提的是，在角叉菜胶致大鼠足肿胀及热板法物理致痛实验中还发现，在给药初期（末次给药后1.5 h左右），巴布贴抗炎、镇痛作用较双氯芬酸二乙胺乳胶剂稍弱，持续作用一段时间后（至少可维持8 h），巴布贴相对双氯芬酸二乙胺乳胶剂仍可发挥较强的药效，推测这可能与巴布贴剂具有一定的“缓释”作用有关。

飞龙九一巴布贴组方选用闽台特色的药食两用草本植物飞龙掌血、九节茶、一条根等，经特殊工艺制成，方中君药飞龙掌血，具有活血化瘀、止痛消肿、祛风除湿之功效;臣药九节茶，可加强祛风除湿、活血止痛之效;佐以一条根，祛瘀消肿;使以温通辛散之辣椒油，可针对KOA早、中期风寒湿瘀蕴结、阻滞经络气血、不通则痛等特点，发挥温经通络、祛风除湿、消肿止痛之功。

现代药理学研究表明，飞龙掌血根皮部分的镇痛效果堪比西药杜冷丁[13]，且经醇提后获得的总生物碱及其水提液等生物活性物质也均具有显著的抗炎、镇痛作用[14]，可调节关节滑膜组织与血清中抗炎、促炎因子的表达，其作用机制可能是通过下调脑组织中前列腺素E2（PGE2）蛋白表达的中枢镇痛机制及降低血清中PGE2含量的外周镇痛机制，从而显著降低关节炎模型大鼠中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量而实现的[15]。本研究结果也与陆怡等[16]利用飞龙掌血醇提取物的抗炎镇痛药效学实验结果相一致。另有文献报道，飞龙掌血主要有效成分茵芋碱能明显缓解小鼠的关节炎性症状，并能通过调节IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子水平，改善关节肿胀、抑制滑膜与关节软骨的过度增生[17]。此外，有学者对草珊瑚研究发现，其抗炎疗效确切，且多糖和乙酸乙酯为其发挥抗炎作用的主要活性成分[18]。

在对一条根的研究中也得到了相似的结果[19]，其通过主要活性物质黄酮类发挥镇痛、抗炎等药理作用[20]。飞龙九一巴布贴组方中所含的辣椒油镇痛、抗炎作用确切，且持久长效[21-22]，主要活性成分辣椒碱是一种极度辛辣的香草酸胺类生物碱，能发挥多种生理药理学活性，尤其可通过对神经肽P物质合成和贮存来实现其突出的镇痛作用[23]。

综上所述，飞龙九一巴布贴对物理、化学致痛及炎症反应均有一定的抑制作用，且药效较持久，为KOA引起的关节肌肉肿胀、酸痛及KOA滑膜炎的临床康复治疗提供了一定的实验依据。在此基础上，课题组今后还将对该贴剂疗效机制展开进一步研究。

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