顶空进样-气相色谱-质谱法测定井矿盐中的短链脂肪酸

冯峰 范广宇 刘通 张峰

摘 要 建立了测定井矿盐中未知异味成分的定性和定量分析方法。将具有异味的井矿盐成品及其原料卤水采用顶空进样，HP-innoWax色谱柱（ 60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）进行分离，电子轰击离子源进行电离，使用扫描离子模式（Scan）对未知异味成分进行定性分析，经过NIST谱库检索和标准品双柱确认，在原料卤水和异味井矿盐成品中分别准确鉴定了13种和5种短链脂肪酸。采用选择离子模式（SIM），基质匹配外标法对井矿盐成品进行定量分析。结果表明，5种短链脂肪酸在0.13～5.00 mg/kg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.995，检出限为0.05～0.20 mg/kg。在0.25、0.50和2.50 mg/kg添加水平時，回收率范围为82.0%～104.0 %，相对标准偏差为5.1%～9.8%（n=6）。本方法简单、灵敏，可用于井矿盐中短链脂肪酸的准确定性定量分析。

关键词 顶空进样; 气相色谱-质谱; 井矿盐; 短链脂肪酸

1 引 言

短链脂肪酸（Short-chain fatty acids， SCFAs）通常指具有1～6个碳原子碳链的有机酸，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸等，它们都有强的挥发性，也被称为挥发性脂肪酸（Volatile fatty acid， VFA）[1]。研究表明，生物体内的短链脂肪酸具有降低结肠内pH 值、抑制致病菌的繁殖、维持益生菌代谢、保持肠道菌群稳态、抑制促炎因子产生、减少炎症反应、促进癌细胞凋亡及控制原癌基因表达等作用[2，3]。然而，由于某些短链脂肪酸含有特殊气味，如果食品中含有过量的短链脂肪酸，会影响消费者对食品的食欲，甚至对相关产品产生恐慌。例如在2017年4月爆发的某公司生产的井矿盐“臭味盐”事件（食盐开袋即有浓烈的臭味），就是因为缺乏可靠、有效的异味成分分析鉴定方法，未能及时识别出其中残留的短链脂肪酸，导致消费者恐慌。

目前，短链脂肪酸的测定方法[4]主要有离子色谱法[5，6]、气相色谱法[7～10]、液相色谱法[11～13]、气相色谱-质谱法[14～16]和液相色谱-串联质谱法[17]等，但这些方法主要是针对环境样品、工业废水、发酵产物和生物样品中的若干种特定短链脂肪酸而展开，而对于食品中大量短链脂肪酸同时进行测定的方法还未见报道。

本研究建立了一种快速、准确、灵敏测定井矿盐中未知短链脂肪酸的分析方法，并成功应用于臭味盐中未知异味成分分析，在井盐原料中共定性检测到13种短链脂肪酸成分，并定量检测了最终产品中残留的5种短链脂肪酸。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司），配有CTC PAL顶空进样器和ChemStation E.02工作站; HP-innoWax毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）; Milli-Q Advantage A10超纯水机（美国Millipore公司）; XP 105分析天平（瑞士Mettler公司）; PB-10型pH计（德国Sartorius公司）。

乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、戊酸、2-甲基戊酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、2-乙基丁酸、己酸和2-甲基己酸标准品（纯度>99%，Dr.Ehrenstorfer公司）; NaCl（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）; 其它试剂均为分析纯; 实验用水为超纯水。

2.2 标准溶液配制

分别取乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸标准品适量，用超纯水溶解，配制成1000 mg/L的标准储备溶液。取配制好的标准储备溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，用超纯水定容，配制成100 mg/L的混合标准溶液，使用时逐级稀释到所需浓度。

井矿盐短链脂肪酸定量用标准溶液配制： 称取8.00 g NaCl于20 mL顶空进样瓶中，加入不同量的标准溶液，配制0.05、0.125、0.25、0.50、2.50和5.00 mg/kg的系列加标样品，然后加入200 μL 0.2% H3PO4溶液，迅速密封，垂直瓶体，水平轻微振荡使之充分混匀，待测。

2.3 样品处理

准确称取井矿盐样品8.00 g于20 mL顶空进样瓶中，加入200 μL 0.2% H3PO4溶液，迅速密封，小心混匀，待测。

2.4 仪器方法

2.4.1 顶空进样条件 顶空振荡室加热温度： 80℃; 加热时间： 30 min; 加热方式： 振荡加热; 顶空进样针温度： 80℃; 进样量： 1 mL，不分流模式; 用高纯氦气推动和清洗顶空针; 清洗时间： 0.5 min。

2.4.2 气相色谱条件 HP-innoWax色谱柱（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）; 升温程序： 初始温度50℃保持1 min，以10℃/min 升至180℃，再以5℃/min升至200℃，保持2 min; 进样口温度： 250℃; 传输线温度： 250℃; 载气： 高纯氦，纯度>99.999%; 流速： 1.0 mL/min。

2.4.3 质谱条件 离子源： EI电离源;电子能量： 70 eV; 四极杆温度： 150℃; 离子源温度： 230℃; 扫描方式： 未知成分分析时使用扫描离子模式（SCAN）; 短链脂肪酸定量时使用选择离子扫描模式（SIM）。

3 结果与讨论

3.1 井矿盐中异味成分的定性分析

根据食用盐国家标准[18]，食用盐应无异味。 臭味井矿盐可闻到臭味，推测其中的异味成分为某些挥发性成分，采用气相色谱-质谱的进行了分析。考虑到井矿盐在生产加工工艺中主要是通过对来自矿井中的卤水进行加热处理以去除水分，加热过程会引起挥发性成分的损失，因此，本研究首先对从臭味盐事发公司现场采集的用于井矿盐生产的卤水使用顶空进样、GC-MS/SCAN 全扫描模式进行检测，对于检测到的所有色谱峰，使用NIST谱库进行初步的识别，卤水中的挥发性成分主要是短链脂肪酸成分。对于检出的这些化合物，通过标准品进行了鉴定，并使用极性不同的色谱柱（DB-1701）进行确认，结果共鉴定出13种短链脂肪酸成分。

在完成卤水中异味成分的分析后，本研究也对开袋有异味的井矿盐产品中的挥发性成分进行了识别，结果表明，井矿盐产品中仅有5种短链脂肪酸成分（乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸）被检出。对于检出的这些短链脂肪酸，依据《食品添加剂使用标准》，均属于“允许使用的食用合成香料”[17]。

3.2 井矿盐中短链脂肪酸定量分析条件优化

对于短链脂肪酸的定量分析，常用的色谱柱是DB-FFAP，其固定相是硝基对苯二甲酸改性的聚乙二醇（PEG）。本研究选择了同样以PEG为固定相的HP-innoWax色谱柱进行分离条件和质谱条件的优化，最终确定的升温程序见2.4.2节，5种短链脂肪酸的气相色谱-质谱检测的定量和定性离子信息见表1。

在井矿盐中，短链脂肪酸会以HA（游离型）和A（离子型） 两种形式同时存在，其解离状态受样品pH值影响。而顶空进样分析是根据待测物质在气液平衡或者气固液平衡时气态中的浓度进行定量分析，因此，选择合适的pH值以确保短链脂肪酸在井矿盐中尽量以游离态存在，可提高检测的灵敏度。本研究首先考察了样品直接顶空进样、样品加水顶空进样和样品加磷酸溶液顶空进样3种条件下的灵敏度，结果表明，短链脂肪酸加H3PO4溶液的响应最高，直接顶空进样时响应最低。推测是因为存在于食盐中的短链脂肪酸（HA）为弱酸性，在中性条件下处于A状态，与食盐中的Na+等相结合，挥发性变差; 当加入H3PO4后，离子形式存在的短链脂肪酸转化为分子形式挥发出来，使得响应增高。 考虑到H3PO4不易挥发，不同于HCl、HNO3等具有挥发性，可避免对样品检测的影响， 因此采用H3PO4溶液调整pH值。

H3PO4的加入量对整个体系的pH值有重要影响，过低的pH值甚至会引起食盐中的Cl转化成HCl而挥发出来，从而影响检测，并降低色谱柱使用寿命。本研究进一步考察了H3PO4加入量对短链脂肪酸检测灵敏度的影响，在5种短链脂肪酸的浓度均为1.25 mg/kg的加标样品中，分别添加0、0.2、0.5、1.0和5.0 mL 的0.2%（V/V）H3PO4，然后进行检测。5种短链脂肪酸的信号响应强度，当不添加H3PO4溶液時，响应值较低，当加入0.2 mL短链脂肪酸后，响应值即达最高值，随着H3PO4加入量增加，信号强度又呈现不断下降的趋势。因此，最终选择加入0.2 mL 0.2%（V/V）H3PO4。

3.3 井矿盐中短链脂肪酸定量分析方法学考察

在优化的分析条件下，采用在NaCl中添加不同量的短链脂肪酸混和标准溶液配制成基质标准溶液，采用建立的顶空进样、气相色谱质谱方法进行检测，进行井矿盐中短链脂肪酸检测的方法学考察。5种短链脂肪酸在0.125～5.00 mg/kg浓度范围内，色谱峰面积与浓度的线性关系良好，标准曲线方程、相关系数和检出限（ S/N≥3）结果见表2。在空白井矿盐样品中对每种短链脂肪酸各设定3个不同添加水平，每个添加浓度重复进行6 次实验，测定回收率。结果表明，本方法的回收率在82%～104 %之间，相对标准偏差为5.1%～9.8%（n=6）。

3.4 实际样品分析采用本方法对于从市场上随机采购的包括井矿盐、湖盐、海盐等类型无异味食盐样品30份，与在“臭味盐”事发公司现场收集到的臭味盐进行定量分析，结果表明，无异味的食盐样品中均未有短链脂肪酸成分检出，有“臭味”的井矿盐中的丙酸含量大于3 mg/kg，丁酸、异戊酸含量大于1 mg/kg，乙酸、戊酸2种短链脂肪酸有检出但低于线性范围下限，“臭味盐”臭味的浓淡与检出的短链脂肪酸的含量相关。这些检出的短链脂肪酸，尽管均已列入我国食品添加剂使用标准[19]，可以在食品中使用，但相关食盐样品产生的“臭味”，不符合食用盐国家标准[18]中的感官要求，应予以消除。

4 结 论

建立了一种可同时定性定量分析井矿盐中未知异味成分的快速、准确和灵敏的顶空进样-气相色谱-质谱分析方法。将本方法用于异味井矿盐的分析结果表明，这些异味成分均为短链脂肪酸，在市售无异味的食盐中未有短链脂肪酸检出。本方法也可用于其它食品中短链脂肪酸的检测。

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