肝癌循环肿瘤细胞研究进展

刘佳易 肖恩华*

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）最初是由澳大利亚医生Thomas于1869年在乳腺癌病人血液中发现，它是从原发实体肿瘤转移到外周循环或淋巴系统并最终在骨髓、淋巴结或被转移的器官中生长的肿瘤细胞[1]。它的生长和传播贯穿了肿瘤生长的各个时期。

肝癌是全球第六大常见肿瘤，致死率位列第二[2]。它具有高致死率和高复发率等特点，早期诊断和治疗也是临床应对肝癌处置的难点。早期筛查有利于延长肝癌病人的生存时间，早期确诊也有利于采用多种治疗方式，从而改善预后[3]。但事实上，临床上仅有30%～40%的肝癌病人能够在早期获得有效的治疗，且仅有少数几种生物标志物作为肝癌评价指标，其中甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）是应用最为广泛的生物标志物。但AFP目前存在一定的局限性，如假阳性结果比例较高，缺乏足够的敏感性和特异性。

近年来CTC检测在肝癌中的应用可谓发展迅速，包括机制研究、检测技术的更新、早期诊断、治疗或预后评价等多方面。本文结合近5年有关肝癌CTC研究的最新成果进行综述。

1 CTC转移机制及转移特性

1.1 转移机制 CTC转移机制大致包括CTC分离、细胞表面物质转化、聚集、黏附等4个步骤[4]。CTC分离的开始阶段为原发肿瘤侵犯邻近血管或新生血管形成，随着血液的剪切力冲击血管壁，肿瘤CTC从原发病灶中分离出来。传统观念认为，肝癌CTC与原发肿瘤分离后，细胞表面物质将继续保持固定的表型，并一直到继发转移病灶出现，因而不存在CTC表面物质的转化。近年来研究发现，肝静脉中的CTC表面特征与上皮细胞接近，而在向远处迁移过程中CTC表面间充质特征更加明显。有研究者[1]认为，CTC的间充质表现可能类似于火车头样改变，即CTC按照链条状结构排列，位于前位的CTC细胞不断的发生间充质转化，而位于后位的CTC细胞转化率较低。正常细胞脱离组织或细胞外基质会出现失巢凋亡，但CTC可通过聚集的方式来抵抗失巢凋亡的发生[2]。CTC间充质表型在聚集过程中起到促进作用，微血管栓塞或血栓形成可导致局部缺氧从而诱导上皮间充质转化 （epithelial to mesenchymal，EMT）。同时，激活EMT分化的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和表皮生长因子受体 （epidermal growth factor receptor，EGFR）等趋化因子水平也明显升高。此外，CTC表面蛋白的高表达也有助于CTC聚集，如波形蛋白等。这些病理生理变化都为CTC聚集提供了条件，从而为CTC在原发肿瘤外的生长提供了保障[3]。

当CTC途经点附近血流速度降低或通过较细的毛细血管时，较大的CTC或循环肿瘤微栓子（circulating tumor microemboli，CTM）会出现滞留，此现象与血管血栓形成密切相关，尤其在微血管中的栓塞现象更为明显[4]。同时，CTC在表面黏附分子、趋化因子、外泌体等多种物质作用下，CTC最终黏附于血管内皮细胞上方。

1.2 转移特征 根据肿瘤干细胞假说，有研究者[5]对CTC是否具有干细胞特征进行了探究，发现CTC可表达肿瘤干细胞表面生物标志物 （如CD90、CD44）并激活WNT信号通路；在蛋白水平的检测发现β-连环蛋白、波形蛋白，它们在细胞质和细胞核中均有不同程度积累。因此，CTC具有肿瘤干细胞的特性，这可能是肿瘤转移和复发的“种子”。

有研究[1]发现与原发肿瘤处静脉CTC数量相比，外周动脉CTC数量显著减少，从而证实CTC在体内不同血管中的数量存在差异。可能由于CTC通过肺毛细血管被较小管径的血管滤过后数量减少，这与肝癌病人肺转移概率大的情况相吻合。

CTM为CTC聚集而成，它的侵袭能力和黏附能力明显高于单个CTC。在动物实验[6]中，研究人员从肝癌小鼠肝静脉中提取出了CTM，在小鼠肺静脉中并没有发现CTM的存在，但在外周静脉中被检测出来。可能与肺毛细血管滤过有关，并且单个CTC可能会自发聚集，以减轻来自血流微环境的影响。因此，CTC聚集可能代表一个动态的过程而不是随机的过程。

2 CTC检测技术

2.1 物理学方法 CTC的物理学检测主要利用CTC的物理学特性，包括密度、大小、迁移能力、变形性和电荷等。其中单纯过滤法对CTC进行提取的检测方式基于CTC与其他血细胞大小不同的原理，其中肿瘤细胞直径（17～52 μm）大于红细胞（6～8 μm）和白细胞（7～15 μm）[7]。 然而，滤过会受到多种因素的影响，如流速、滤孔压力、细胞表面黏度等[8]。此外，CTC的物理特性与正常血液细胞可能存在相同之处，单一使用该方法可能有时难以保证CTC检测的特异性。因此，多种过滤装置（过滤网、梯度离心）相结合，可能会进一步提高CTC检出的准确率[9]。在多种物理滤过法相结合的检测技术中，Rarecells公司开发的ISET®捕获仪是其中的代表之一，它的优势是可以提高CTC检测敏感度，并从血液中提取含量稀少的CTC和CTM，同时最大限度保持形态和结构完整[10]。

2.2 生物学方法 CTC的生物学检测主要依靠肝癌表面特异性靶点，如上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）[11]及特定的生物学表型如上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）来达到检测目的。目前Cellsearch是唯一一种通过美国FDA认证的检测方法，它利用的就是EpCAM抗体捕捉CTC的方法，因为其检测敏感度较高，在多种肿瘤的研究中均有应用。但该方法存在一定的局限性，如在肝癌CTC中，仅有30%~40%的CTC表达EpCAM且Cellsearch方法仅能检测CTC的数量，缺乏有效的表型鉴定及收集CTC上皮特征信息的功能。其他原理大致相同的技术如微流控芯片 （CTC-iChip）[12]、体内上皮细胞采样针（CellCollector）[13]等。EMT检测则主要通过内皮样或间质样标志物，如CD31、胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ型，从而达到检测的目的。它们在保证检测CTC的敏感性和特异性的同时，对CTC表面物质进行分析并提取具有活性的CTC，提取出的CTC采用免疫组织化学、免疫染色和PT-PCR等方法进一步对CTC下游过程进行验证[14]。

2.3 其他检测方法 最近的研究[15]表明CTC检测手段获得的结果并不完全一致，主要表现在结果的可重复性差、表面分子标志物及表型检测手段单一等方面。与此同时，基于不同原理的新技术的不断产生，促进了CTC检测的发展，包括仿生纳米技术、生物学和物理学相结合的国产CanPatrol®检测技术、不需要生物抗体结合的流式CTC检测技术等[16-18]。因此，在选择CTC作为临床观察指标的过程中，反复抽样或与其他检测方式的联合可能有助于提高CTC检测结果的稳定性。

3 CTC在肝癌早期诊断中的应用

肝癌通过循环系统向远处转移是一种被广泛认可的传播方式，早期肝癌就可能存在转移，因此CTC的检测在肝癌的早期诊断中具有一定的优势。

在CTC研究的早期阶段，对肝癌早期诊断主要是通过对CTC数量进行评估。CTC数量与标准的巴塞罗那（Barcelona-Clínic Liver Cancer,BCLC）分期、血清AFP水平间存在明显正相关性。不仅CTC数量与分期相关，CTC不同表型（如上皮表型、间充质表型、杂交表型等）也与分期存在较好的相关性[16]。

随着技术的发展和与其他学科的交叉运用，CTC在肝癌的早期诊断中的准确性有了进一步提升。例如将CTC与基因组学的结合，Lustberg等[17]采用微流控芯片(microfluidic chip,iChip)直接滤出血液中的红细胞、血小板、血浆等成分，同时保留了具有活性的CTC，通过与PCR技术相结合，在早期肝癌和AFP阴性的病人外周血中找到CTC。此外，CTC检测与其他生物标志物的检测方法相结合形成多标志物模型更是将诊断的敏感度和特异度提高到了90%以上[18]。利用不同数学模型的方法，例如逻辑回归和分类与回归树，在不同病因下与CTC检测结果进行结合后建模分析，也为诊断早期肝癌提供了较高的稳定性和准确性[19]。

值得注意的是，Wang等[20]的一项回顾分析研究中，对比不同组检测手段在肝癌诊断中的准确性，不建议将CTC检测作为肝癌的一种独立的诊断工具。

4 CTC在肝癌复发和预后中的应用

多项研究表明，CTC与肝癌复发及预后密切相关。Liu等[21]收集了123例肝癌根治性切除术病人的血样，提示EpCAM阳性CTC可作为实时监测治疗疗效的指标，也可作为肝癌复发的治疗靶点。术前EpCAM阳性CTC计数≥2是肝癌病人术后肿瘤复发的独立预测因子，尤其在AFP水平≤400 ng/mL的病人亚组中，其复发比例与AFP水平＞400 ng/mL的病人间差异有统计学意义。Kalinich等[22]将299例接受不同治疗方案的肝癌病人与120例未患肝癌者的CTC计数对比后发现，EpCAM阳性的CTC不仅可用于早期治疗决策，而且可以对病人早期复发率的评估提供判断依据。Liu等[21]首次报道利用干细胞表型 （CD90+，CD44+）CTC对肝癌切除术复发进行评价。角蛋白K19被证明是肝癌CTC干细胞表型标志物，在CTC细胞检测中作为辅助标志物对预后有着重要意义。

CTC中RNA水平也具有一定的临床意义，研究表明将所提取的CTC中RNA进行qRT-PCR检测不仅能对肝癌诊断有效，而且也是预测肝癌术后复发的评价工具。Okajima等[23]通过对肝癌切除术后随访病人血液标本CTC基因学检测，证实肿瘤特异性抗原MAGE基因对肝癌预测预后和监测治疗疗效有一定临床价值，GPC-3基因的高表达可以作为评价肝癌的早期复发的可靠生物标志物。AFP、EpCAM、CD90、CD133和CK19的联合检测与单独测量AFP和EpCAM阳性CTC相比，前者具有更高的特异性；检测亚洲人群慢性乙肝和肝硬化病人的肝癌发生率时，它的效应值更高[24]。

CTC的间充质表型提高了CTC向血管侵犯的能力，进而增加了转移风险。一项研究[25]通过对CTC中波形蛋白进行分析评价了46例肝癌转移病人CTC可能具有的间叶组织特性，结果显示与对照组相比，实验组中80.4%的病人波形蛋白存在过表达，且波形蛋白表达的程度与并发症的发生率存在明显的正相关。

5 CTC在肝癌中的应用前景

CTC在传播过程中存在表型异质性，而人体各部位CTC存在数量的异质性，这些现象背后机制的问题仍不清楚，因此CTC异质性的检测成为了目前CTC研究中需要重点解决的问题。相关机制研究主要集中在基因、分子水平，Sun等[26]通过利用DNA倍体分析、阵列比较基因组杂交等技术，证实42%~53%的复发肿瘤的基因型与原发肿瘤的基因型存在明显差异，且不同基因型所对应的复发中位数时间也存在明显不同。另一方面，肿瘤在生长和自然选择过程中，肿瘤内部的成分发生了诸多变化，瘤内分子成分同样存在异质性。β-连环蛋白、谷氨酰胺合成酶、CK7、CD44、EpCAM 以及 TP53和 CCNB1突变体等被认为与肝癌瘤内异质性有关[27]。因此，未来的研究结合基因组学和蛋白组学，如CTC单细胞测序、蛋白芯片等方式，将有可能以纵向和动态的方式在基因和分子水平揭示CTC转移过程的全貌。

CTC在人体内的分布不均匀，尤其在原发肿瘤回流静脉中含量较高，如肝癌中肝静脉是CTC数量增高明显的区域。因此，肝脏CTC的拦截可能是未来治疗的新手段，例如通过介入手段在肝静脉内植入肝癌细胞滤器从而阻断从原位肝癌中分离的CTC，将可能降低肝癌病人术后肺转移的风险。

在治疗和预后评估方面，有关肝癌CTC的临床实验主要集中在肝癌切除术后评价，对于其他术式如选择性肝动脉化学栓塞（TACE）、肝移植、肝射频消融和化疗药物、分子靶向药物在临床的应用等方面的研究目前少有文献报道。未来更多的临床实验并结合分子影像学或基因组学等技术手段将进一步阐明CTC在肝癌治疗和预后中的作用[28]。

6 总结

CTC是一种新型而具有应用前景的生物标志物。在肝癌的各个阶段如诊断、治疗方案的选择、预后等方面均有重要的应用价值。随着技术的不断发展，CTC的检测比以往具有更高的准确性。更多多中心前瞻性研究的数据将为CTC检测准确性和临床评估提供强有力的证据。尽管如此，缺乏标准化的技术流程是其目前未能广泛运用于临床工作中的原因之一。各研究中对检测技术的选择、病人的入组条件、样本类型等方面也存在差异。因此，在未来的研究中，对检测方法的统一、严格的纳入和排除标准、合理的标本取材和储存等方面需要更加重视。