惠州市围生期妇女B族链球菌耐药性及其耐药基因分析

林保安

[摘要]目的 分析围生期妇女B族链球菌的耐药性及其耐药基因。方法 选取2016年1月～2017年9月惠州市第一妇幼保健院产科收治的657例围生期妇女，取其生殖道分泌物，对B族链球菌进行培养检测，同时对培养出的B族链球菌进行药敏试验，观察其耐药性和分析耐药基因。结果 在657例围生期妇女中检出B族链球菌携带者有213例，带菌率为32.4%，其中≥30岁组的围生期妇女带菌率为42.3%，<30岁组的带菌率为29.8%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。B族链球菌对青霉素的耐药率为0.8%，红霉素为31.2%，头孢曲松为6.3%，左氧氟沙星为22.5%，克林霉素为25.9%，四环素为63.2%，万古霉素为0.0%，利奈唑胺为0.3%，呋喃妥因为11.3%，氨苄西林为2.6%，D-抑菌圈试 头孢曲松的敏感性高，可根据患者的具体病情选择合适的药物进行治疗。

[关鍵词]围生期妇女;B族链球菌;耐药性;耐药基因

[中图分类号] R378.1+2          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）1（c）-0142-04

围生期是指孕妇怀孕28周到产后1周，是孕妇人生中的重要时刻，在这段时间中，孕妇会进行各种检查来确保自身和孩子的安全。B族链球菌又称无乳链球菌，是一类β溶血的需氧革兰阳性链球菌，一般存在于人体的下消化道，也可寄居于女性下生殖道，正常人在一般情况下感染可不致病，但该菌是导致母胎感染的重要菌素[1]，其与新生儿感染、晚期流产、围生期感染等疾病密切相关。B族链球菌早期可引起牛乳房炎，因此被畜医界所重视，但是随着医学的发展，人们逐渐发现该致病菌的感染不只限于牛乳房炎，对人体也有很大的危害性。1938年Fry首次报道3例患者因感染B族链球菌引发心内膜炎而导致死亡，证明B族链球菌为人类的致病菌。经过不断研究，发现B族链球菌可引起孕妇早产、胎膜感染、胎膜早破及引起子宫内膜感染等，新生儿感染B族链球菌可导致肺炎、脑膜炎、败血症甚至死亡，而在感染后存活下来的新生儿中，还可能存在智力障碍、脑积水、耳聋、畸形等并发症。有关研究表明，我国妊娠妇女的B族链球菌带菌率为3.5%～32.4%，国外妊娠妇女的带菌率为10%～30%，正常人的带菌率为15%～35%[2]，B族链球菌为围生期妇女感染的主要致病菌。目前国内外对于B族链球菌的防治都采用β内酰胺抗生素，而对于过敏性人群和轻微感染者常采用大环内酯类抗生素[3]，但近年来由于抗生素的广泛使用，B族链球菌的耐药性逐年上升。本研究选取426例围生期妇女，对B族链球菌的耐药性和耐药基因进行分析，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年1月～2017年9月惠州市第一妇幼保健院产科收治的657例围生期妇女，孕龄35～37周，年龄20～36岁，平均（26.4±3.5）岁。657例孕妇按年龄分分为两组，≥30岁组235例，<30岁组422例。纳入标准：在我院进行产前检查的孕妇，正常妊娠，年龄为20～40岁的孕妇。排除标准：近2周内使用过抗生素;近2周内有过性生活;有严重慢性疾病合并心脑肾等重要脏器功能受损者;意识不清楚;有精神疾病。所有患者均同意参加本研究，且都已签署知情同意书。本研究已经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2仪器与试剂

培养B族链球菌的培养基为哥伦比亚血琼脂基础培养基、ToddHewrtt培养肉汤和绵阳血清培养基，均为上海玛嘉微生物技术有限公司的产品[4]。B族链球菌的鉴定采用法国生物梅里埃公司VITEK2全自动细菌鉴定分析仪，药敏定量试验采用法国生物梅里埃的VITEK2全自动鉴定药敏仪[5]。质控菌株为肺炎链球菌ACTT49615，该产品于中国卫生部临床检验中心采购。DNA提取试剂盒（批号54926）为中国北京生物工程有限公司提供，D-抑菌圈试验使用美国OXOID公司的纸片。

1.3标本采集

由我院妇产科医生对孕妇采集生殖道分泌物标本。孕妇于2周前未使用过任何抗菌药物，未进行过性生活，采集部位没有使用过栓剂和清洗液，未进行任何清洗[6]，将阴道采用消毒过后的扩阴器打开，用无菌棉签拭子涂擦阴道下1/3处，将采集好的标本放置于容器内并于30 min内送检。

1.4菌株鉴定

将采集好的无菌棉签拭子放置到B族链球菌选择性增菌肉汤中，环境温度保持在35 ℃以下[7]，经过一夜的培养后，进而接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，温度继续保持在35 ℃以下，空气为5%CO2，培养24～48 h，选择中等大小、灰白色的菌群于血琼脂培养基上给予纯培养，并进行革兰染色，最后于显微镜下进行触酶试验、CAMP试验以及ATB32streP板条鉴定菌落的种类[8]。

1.5药敏试验

选取青霉素、万古霉素、利奈唑胺、胺苄西林、头孢曲松、呋喃妥因、左氧氟沙星、克林霉素、红霉素、四环素抗菌药物纸片进行药敏试验，将准备测试的菌落稀释为0.5麦氏单位后接种到绵阳血清培养基上，待菌液风干后将抗菌药物纸片贴在上面，间距为12 mm，在35℃、5%CO2的条件下培养24～48 h[9]，参照美国临床和实验室标准化协会制定的MI00-S22文种对药敏结果进行判断，对于克林霉素、红霉素敏感的或中介的菌株，运用纸片扩散法进行D-抑菌圈实验。

1.6耐药基因检测

采用PCR方法检测D-抑菌圈试验阳性B族链球菌菌株的耐药基因，反应体系总体积25 μl，其中包括ddH2O 17 μl 10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，Taq DNA Polymerase 0.25 μl，镁离子1.5 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 1.25 μl，反应条件为：5 min 95℃预变性[10]，95℃变性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，总共进行35个循环，最后一个循环结束后72℃ 10 min，最后在4℃的条件下保存PCR产物[11]。

1.7统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 围生期妇女B族链球菌带菌率

在657例围生期妇女中检出B族链球菌携带者213例，带菌率为32.4%，其中≥30岁组的围生期妇女带菌率为42.3%，<30岁组的带菌率为29.8%，两组比较，差异有统计学意义（χ2=18.045，P<0.05）。

2.2 围生期妇女B族链球菌耐药性分析

对213例B族链球菌进行药物敏感试验，结果显示，B族链球菌对克林霉素、红霉素、四环素、左氧氟沙星耐药性较高，分别为25.9%、31.2%、63.2%、22.5%;对青霉素、万古霉素、利奈唑胺、胺苄西林、呋喃妥因和头孢曲松的敏感性高，分别为99.2%、100.0%、99.7%、97.4%、88.4%、93.7%（表1）。

2.3 D-抑菌圈试验结果

213例B族链球菌中，对克林霉素敏感、红霉素耐药或者中介者56例，在56例中D-抑菌圈试验阳性者有14例，阳性率为25.0%。

2.4围生期妇女B族链球菌耐药基因分析

在213例感染的B族链球菌中，四环素的耐药基因以tetM、tetO、tetK、tetL为主，其阳性率分别为71.2%、54.3%、16.7%、46.5%，其中包含两种或两种以上的tet基因占71.8%;红霉素的耐药基因主要以ermB为主，其阳性率为31.6%，mefA基因阳性为21.3%，mefE基因阳性为29.8%，ermC基因阳性和ermTR基因阳性分别有12例，同时含有erm基因和erfA和mefE基因的为36.8%。

3讨论

B族链球菌是一种条件致病菌，主要存在于人体的阴道和直肠，在人体免疫力低下时，内环境可出现异常，导致机体失去平衡而发生感染，如果不进行及时有效的干预，易引发多种类型的感染。B族链球菌是导致围生期妇女感染的主要致病菌之一，孕妇感染B族链球菌的早期表现为外阴瘙痒、阴道分泌物增多，尿频等，随着时间的延长，孕妇到了围生期可导致胎膜早破、子宫内膜感染和晚期流产等并发症。新生儿感染B族链球菌可导致脑膜炎、肺炎、败血症等感染性疾病，发病率和死亡率较高，有关研究表明，在围生期孕妇感染B族链球菌新生儿败血症的发生率比未感染B族链球菌的围生期妇女高25倍[12]，且其带菌率随着地区、种族、年龄的不同而有差别，有研究表明，妊娠期妇女的带菌率为10%～30%，健康人群的带菌率为15%～35%，我国南京地区的孕妇带菌率为4.2%，江西地区的带菌率为8.76%，上海地区的带菌率为3.70%，北京地区的带菌率为7.10%[13]。对围生期妇女采集阴道分泌物进行B族链球菌的筛查，同时对检测出的B族链球菌感染的患者进行抗生素的预防用药，可极大地降低孕妇和新生儿感染的危险。

B族链球菌的检查方法主要有血清学检测和细菌培养法，细菌培养法是确诊B族链球菌的有效方法。本研究所采用的是细菌培养法，检测出有213例围生期妇女感染B族链球菌，带菌率为32.4%，提示在围生期妇女中B族链球菌感染率较高，临床上应予以重视。细菌培养法的不足之处在于对B族链球菌的分离培养和诊断过程耗费时间长且相对复杂，血清学检测可大大缩短时间，但是容易出现假阴性和假阳性，在临床上都不能广泛应用。现在分子生物学技术被广泛应用于临床上，荧光定量PCR技术已经成为临床诊断中的一种重要技术，其特点为准确性高，速度快，敏感性高，取得的标本送到实验室之后40～100 min内就可得到准确的检查结果，但其对检测人员和设备的要求较高，且费用相对比较昂贵，并且不能获得药敏试验结果[14]。

对感染B族链球菌的围生期妇女应给予积极有效的治疗，及时采取抗生素治疗可以有效减少围生期妇女和新生儿感染的发生，美国疾病预防控制中心推荐选取青霉素G、胺苄西林来预防围生期妇女B族链球菌的感染，对此类药物过敏的患者，可使用克林霉素和红霉素[15]。抗菌药物的广泛使用使B族链球菌的耐药性越来越高，本研究结果显示，B族链球菌对青霉素、萬古霉素、利奈唑胺、胺苄西林、呋喃妥因和头孢曲松敏感性分别为99.2%、100%、99.7%、97.4%、88.4%、93.7%，提示青霉素和万古霉素是治疗B族链球菌感染患者的首选药物，对克林霉素、红霉素、四环素、左氧氟沙星耐药性较高，分别为25.9%、31.2%、63.2%、22.5%，这可能与目前临床上广泛应用青霉素有关，滥用抗生素对多数的敏感菌株产生影响，且不能被消灭的耐药菌率就大量繁殖，在很大程度上代替了敏感菌株，使B族链球菌对该种药物的耐药率不断上升。同时本研究结果显示，红霉素的耐药基因主要以ermB为主，其阳性率为31.6%，mefA基因阳性为21.3%，mefE基因阳性为29.8%，ermC基因阳性和ermTR基因阳性分别有12例，同时含有erm基因和erfA和mefE基因的为36.8%，四环素的耐药基因以tetM、tetO、tetK、tetL为主，在很大程度上增加了患者的耐药性，使得这些基因能在菌群之间大量传播。

综上所述，围生期妇女B族链球菌感染发生的风险较大，为了进一步控制和防止其耐药性的发展，应对其耐药基因进行全面检测，根据患者的具体病情选择合适的药物进行治疗。

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（收稿日期：2018-07-26  本文编辑：张晨晖）