不同激素对白及种子无菌萌发生长的影响

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(武昌理工学院生命科学学院，生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430223)

白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)为兰科白及属多年生草本植物，其块茎是我国传统中药，具有收敛止血、消肿生肌的功效，近年来还被发现具有抗肿瘤作用，市场对白及的需求量十分旺盛。白及种子众多，一个蒴果内含数万粒种子，但是种子不含胚乳，需要共生菌共生萌发，在自然条件下很难萌发和生长，分株繁殖难以满足规模栽培的需要。应用组织培养技术建立白及种子的高效萌发和增殖体系可以实现白及种子的资源利用、白及种苗的快速繁殖和种质资源的保存。

目前白及的组织培养有较多报道，假鳞茎[1]、幼根、茎尖、叶片[2]、蒴果[3-10]都是常用的外植体，其中叶片的培养尚无报道，种子的培养效果较好。在种子萌发的研究中，应用最多的激素是6-BA 和NAA，KT、2，4-D、GA3也有少量应用。激素使用的浓度区间集中为0～3.0 mg/L，激素对种子萌发的作用结论各异。张燕等研究表明，1.0 mg/L NAA适合种子萌发，0.1 mg/L 6-BA和NAA组合会降低种子萌发率[8]。赵漫丽等研究表明，2.0 mg/L以下浓度的6-BA和1.0 mg/L NAA组合促进种子萌发[5]。王楷等研究表明,1.0 mg/L 6-BA适合白及种子萌发[4]。赤霉素作用报道很少,激素对白及种子的萌发作用缺乏系统研究。本实验采用三因素三水平正交实验，筛选适合白及种子萌发的激素条件，研究激素对白及种子萌发的作用。

1 材料、仪器与试剂

白及蒴果购于湖北省京山县湖北聚通白及种植合作社基地，经武昌理工学院张国彬教师鉴定为白及蒴果。种子为紫花三叉白及品种，胚龄20～21周[3]。

SW-CJ-2 FD 洁净工作台、SPX-250 B-G 光照培养箱、YXQ-LS-50立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；6-BA、NAA、GA3购于美国sigma公司，其他试剂为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 白及种子的接种培养

以1/2 MS为基本培养基，按表1添加不同浓度的6-BA 、NAA、GA3形成9种不同的种子萌发培养基，同时配制0.2% 稀琼脂溶液用于种子的涂布。将白及蒴果消毒后取出种子，加入到稀琼脂中分散成种子悬液，转移到培养基上用涂布棒涂布均匀[7]，每种培养基接种4个培养皿，共36个样品，转入光照培养箱培养。在实验完成后1周内重复本实验2次。

表1 白及种子萌发培养基

2.2 不同培养基上白及种子的萌发生长情况

从接种次日起，每天观察种子的萌发情况，记录种子的形态变化，重点记录各培养基上种子的初萌时间、萌发率、幼苗大小和生长状态，1周进行1次统计分析。其中初萌时间以培养基上10%的种子萌发为标准，30 d后统计种子萌发结果。在不含激素的1号培养基上，3 d后白及种子体积增大(图1)，1周后种子显著转绿，10 d时种胚形成直径1～2 mm的原球茎，部分原球茎可突破种皮(图2)，2周左右可见芽点，种子萌发。添加有植物激素的培养基中，种胚转绿、萌发时间提前，例如3号培养基中2周时原球茎体积约为1号中的4倍，可见长出的幼叶(图3)。GA3对种子萌发方式影响显著，不含赤霉素的培养基中，种子主要以原球茎方式萌发，含赤霉素的培养基中种子多数以直接方式萌发，表现为叶轴伸长，基部颜色变浅(图4)。30 d后所有培养基上的种子都已经萌发(图5)，各培养基中的萌发效果不同(表2)，高浓度即1.0 mg/L的赤霉素易导致白及幼苗玻璃化(图6)，0.5 mg/L的赤霉素与高浓度即1.0 mg/L的NAA组合也会导致幼苗生长后期发生玻璃化。

图1 接种4 d的白及种子

图2 10 d 1号培养基上种子萌发

图3 2周3号培养基上种子萌发

图4 2周5号培养基上种子萌发

图5 30 d 1号培养基上种子萌发

图6 30 d 9号培养基上种子萌发

从表2可以看出，激素对白及种子萌发有重要影响，添加1.0 mg/L以下浓度的外源6-BA和NAA可以提高种子发芽率，促进种子提早萌发。赤霉素影响种子的发芽方式，促进种子早萌，同时会引起种苗发生严重的玻璃化，6-BA可起拮抗作用降低赤霉素引起的玻璃化效应，NAA组合可加重玻璃化效应。由于没有进行赤霉素诱导萌发后转移种子至无赤霉素培养基上的继代培养实验，无法确定种子萌发后去掉赤霉素种子是否会发生玻璃化，推测该措施有一定的抑制玻璃化的作用。赤霉素和NAA组合可以促进种子细胞的分裂，使种子体积增大，萌发速度加快，叶片生长迅速，但会导致严重的玻璃化现象。

表2 白及种子萌发结果

2.3 白及幼苗的增殖培养

35 d后，将萌发生长良好的白及幼苗转接到MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基中进行增殖培养，观察幼苗增殖情况。在无赤霉素培养基上萌发的幼苗继代后生长良好，芽苗健壮(图7)，后期形成健壮的不定根，适宜移栽(图10)。在含有0.5 mg/L赤霉素的培养基上萌发的幼苗基部容易褐化(图8、图9)，一部分幼苗不易生根。在1.0 mg/L赤霉素培养基上萌发的幼苗基部褐化严重，80%后期死亡。

图7 1号培养基种子继代培养

图8 4号培养基种子继代培养

图9 5号培养基种子继代培养

图10 继代3周后的白及幼苗

3 讨 论

在白及种子无菌萌发实验中，6-BA和NAA应用较多、观点不一，赤霉素应用较少，本实验应用GA3、

6-BA和NAA的不同组合来研究植物激素对白及种子萌发的作用，结果显示1.0 mg/L以下浓度的6-BA和NAA组合可以提高种子的发芽率，GA3在种子萌发早期可以促进种子萌发、影响种子发育方式，但在后期会导致种苗的玻璃化并引起褐化。现有研究中关于白及种子萌发过程的报道较多，玻璃化和褐化少见报道。张燕等的研究表明，白及种子可能以两种方式中的一种萌发，即原球茎途径和根状茎途径[6]。本实验中，不含赤霉素的培养基上白及种子以原球茎途径萌发，含赤霉素的培养基中种子萌发时先膨大呈原球茎结构，然后叶迅速伸长，表现为幼叶直接伸长生长，没有出现典型的根状茎，推测是赤霉素显著促进了叶原基和叶基细胞的分裂和生长。由于6-BA可拮抗赤霉素引起的玻璃化效应，NAA可加重玻璃化效应，推测3种激素之间存在互作，鉴于玻璃化现象没有以萌发率作为有效指标进行方差分析。

6-BA和NAA组合实验中，由于没有对应的单因素实验，无法判断激素组合和单一激素的效果哪个更好，这是本实验后续需要完善的地方。添加赤霉素的培养基，在白及种子开始萌发2周时促进萌发，5周后出现严重的玻璃化和后续培养不同程度的褐化，可能原因是实验中使用的GA3浓度较高，在种子萌发初期进行继代、设计浓度较低于0.5 mg/L的赤霉素培养基培养种子是后续可考虑的方案。