Fibulin-3表达对恶性胸膜间皮瘤细胞的影响*

莫世贤，邓勇军△，刘焕鹏，李 珏，陈理军，赵金燕，张 良

(昆明医科大学第四附属医院/云南省第二人民医院 1胸外科， 2中心实验室， 云南 昆明 650021)

恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)是一种起源于胸膜间皮细胞和胸膜下纤维结缔组织的侵袭性肿瘤，以早期诊断困难、预后差为特点[1-2]。在不同国家，MPM发病率差异较大，国外以澳大利亚最高，发病率大约为3.54/10万，国内每年发病率为0.3～0.5/10万，以云南最高，大约为8.5～17.75/10万[3-4]。目前对该病的诊断及治疗较棘手，早期诊断可以提高MPM患者的生存率，一些用于早期诊断的分子标志物包括间皮素(mesothelin)、癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、CA125、CA153、CA199和CD90等，但其特异性和敏感性均有限。

最近的研究发现纤蛋白3(fibulin-3)在MPM患者的血浆和胸水中水平显著升高，且特异性和敏感性较高[5-7]。Fibulin-3也叫含表皮生长因子结构的fibulin样细胞外基质蛋白1(epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1,EFEMP1)，属于fibulin家族中7个成员中的一员，含有493个氨基酸，是一种细胞外糖蛋白[8]。本研究将人恶性胸膜间皮瘤细胞系SMC-1进行常规培养，转染建立各种fibulin-3表达水平的SMC-1细胞，检测肿瘤细胞的细胞周期、凋亡及fibulin-3分子水平表达的变化，为进一步诊断和治疗MPM提供分子靶点和实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

人恶性胸膜间皮瘤细胞系SMC-1购自上海赛齐生物工程有限公司；以pLV-EGFP-2A为基础构建的过表达质粒和以pLVshRNA-mCherry-2A为基础构建的RNA干扰载体质粒购自北京英茂；感受态大肠杆菌DH5α购自北京博迈德。

2 主要试剂

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培养基和双抗购自HyClone；Plasmid Mini Kit II和Endo-free Plasmid Mini Kit II购自OMEGA；Opti-MEM培养基和Lipo2000购自Invitrogen；兔抗人fibulin-3和间皮素(mesothelin)及鼠抗人β-actin抗体购自Sigma；HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗购自KPL；检测fibulin-3、mesothelin和β-actin的qPCR引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；TRIzol reagent购自MRC；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo Scientific；All-in-OneTMqPCR Mix购自GeneCopoeia。

3 主要方法

3.1载体验证 将购买的质粒转入DH5α感受态细胞中，涂选择平板，37 ℃培养过夜，挑取单克隆菌落扩大培养，质粒小量提取，测序鉴定。

3.2SMC-1细胞的培养 以含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基培养细胞。细胞1×105个细胞接种到T25培养瓶中，37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞生长到80%～90%融合后，取对数生长期的细胞换取新鲜培养基以正常培养条件培养并进行实验。

3.3转染实验 转染前1 d铺6孔板待细胞汇聚70%～75%，分别用100 μL Opti-MEM培养基稀释目的质粒2.5 μg和Lipo2000 8 μL混匀。将稀释好的质粒加入到Lipo2000中混匀、室温孵育5 min待用。6孔板细胞PBS洗2次，加入1.8 mL Opti-MEM培养基，滴加质粒混合物混匀，6 h后用新鲜的完全培养基换液，72 h后用荧光显微镜采图及收集细胞检测。实验分组为空白对照(control)组、过表达(Exp)组、过表达对照(Exp-NC)组、干扰(shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4)组及干扰对照(shRNA-NC)组。shRNA的序列见表1。

表1 靶向fibulin-3的shRNA序列

3.4流式细胞术检测细胞周期及凋亡 收集转染72 h的对照组和实验组细胞采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC避光孵育30 min，然后加入10 μL PI避光孵育10 min；加入1 mL DNA staining solution和10 μL PI，避光孵育30 min，分别用流式检测，收集1×104个细胞计算细胞凋亡率及周期各期百分比。

3.5RT-qPCR检测fibulin-3和mesothelin的mRNA表达 收集转染72 h的对照组和实验组细胞，提取总RNA按TRIzol reagent说明书进行。测定RNA样品纯度和含量后，cDNA合成按逆转录反应试剂盒说明进行。以cDNA为模板，qPCR按20 μL的体系进行。qPCR的条件为:95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s(收集扩增曲线)，共40个循环;72 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s(0.05 ℃/s收集熔解曲线)，25 ℃ 30 s。引物序列见表2。

表2 RT-qPCR的引物序列

3.6Western blot检测fibulin-3和mesothelin的蛋白表达 收集转染72 h的对照组和实验组细胞，按细胞数量1×106个细胞加入100 μL裂解液(每10 mL细胞裂解液中加入1片蛋白酶抑制剂混匀)提取总蛋白。BCA法测定蛋白质浓度。进行SDS-PAGE，电泳后半干转到PVDF膜，加入封闭液2 mL(含5%脱脂牛奶PBST)，室温振摇封闭60 min。将兔抗人fibulin-3和mesothelin单克隆抗体(1∶2 000)及鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶8 000)用含PBST封闭液稀释后分别加入孵育体系，室温振摇60 min后，4 ℃冰箱中孵育过夜。用PBST洗膜3次，每次10 min,将辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗用含PBST封闭液稀释(1∶2 000)后加入孵育体系，室温振摇2 h，用PBST洗膜3次,每次10 min。ECL化学发光检测，60 s后采用化学发光凝胶成像仪检测目的条带。

4 统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示。用GraphPad Prism 5统计软件进行方差齐性检验和单因素方差分析，样本均数间的两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 重组质粒测序鉴定

相关质粒为委托生物技术公司构建，测序结果与预计相符，故商品化所提供的质粒载体符合实验要求。

2 质粒成功转染SMC-1细胞

用fibulin-3过表达和fibulin-3-shRNA载体分别转染SMC-1细胞，72 h后在荧光显微镜下观察到Exp组的细胞表达绿色荧光蛋白，shRNA组的细胞表达红色荧光蛋白，见图1。

Figure 1.The cell transfection rate (72 h after transfection) was observed under fluorescent microscope(×200). A and B: the cells transfected with fibulin-3; C and D: the cells transfected with shRNA.

图1质粒转染细胞荧光图

3 流式细胞术检测细胞周期

与control组相比,Exp组G2期的细胞数量增加(P<0.05)，shRNA2组G2期的细胞数量减少(P<0.05)，见图2。这些结果提示shRNA2可以通过S期细胞阻滞和减少G2/M期细胞数量来影响MPM细胞周期。

Figure 2.The images of flow cytometry and quantitative analysis of the cell cycle distribution of plasmid-transfected cells. Mean±SD.n=5.#P<0.05vscontrol group.

图2质粒转染细胞对细胞周期分布的影响

4 流式细胞术检测细胞凋亡

与control组相比，Exp组的细胞凋亡率下降(P<0.05)，shRNA2组的细胞凋亡率上升(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The images of flow cytometry and quantitative analysis of the apoptosis of plasmid-transfection cells. Mean±SD.n=5.#P<0.05vscontrol group.

图3质粒转染对细胞凋亡的影响

5 RT-qPCR检测fibulin-3和mesothelin的mRNA表达水平

与control组和Exp+NC组比较，fibulin-3+Exp组fibulin-3的mRNA表达水平上升(P<0.05);各shRNA(shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4)组与control组和shRNA+NC组比较，fibulin-3的mRNA表达均下调，其中shRNA2下调最明显(P<0.01)；control组和shRNA+NC组相比，fibulin-3 mRNA表达量的差异无统计学显著性，见图4。

Figure 4.The mRNA expression of fibulin-3 and mesothelin in transfected SMC-1 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsExp-NC group;△P<0.05vsshRNA-NC group.

图4质粒转染SMC-1细胞后fibulin-3和mesothelinmRNA表达水平的变化

6 Western blot检测fibulin-3和mesothelin的蛋白表达水平

转染前后fibulin-3和mesothelin蛋白表达水平的变化与mRNA水平相一致，过表达组水平上升，干扰载体组水平下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

Figure 5.The protein expression of fibulin-3 and mesothelin in transfected SMC-1 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsExp-NC group;△P<0.05vsshRNA-NC group.

图5质粒转染SMC-1细胞后fibulin-3和mesothelin蛋白表达水平的变化

讨 论

MPM是一种致死性极强的肿瘤，其恶性程度高，潜伏期长，早期临床表现无特异性，多数患者被发现时已是晚期。全世界发病率正在上升，预计西方国家在2020～2025年发病率将达到高峰[9-10]。Fibulin-3基因位于染色体2p16，含有11个外显子、1个肽链和5个串联排列的Ca2+结合表皮生长因子样结构域和C末端fibulin结构域。在生理情况下，以单体的形式存在，在正常组织中呈低表达，而在内皮细胞和上皮细胞的基膜中呈高度表达，可介导细胞与细胞、细胞与间质之间的信号传导[11]。曾有研究表明，fibulin-3是一个与血管新生有关的细胞外基质蛋白，存在R345W突变，沉积于视网膜色素上皮细胞内质网，从而刺激血管内皮生长因子的表达，引起血管的增生从而导致脉络膜黄斑变性疾病。同时fibulin-3通过激活Notch通路，在恶性神经胶质瘤中表达上调，促进恶性神经胶质瘤的侵袭和转移。美国纽约大学Langone医学中心的Harvey I.Pass博士及其研究人员研究发现，MPM患者血浆和胸水中的fibulin-3水平升高，其中接触石棉胸膜间皮瘤患者更为显著[12-13]。近年来许多实验也证明fibulin-3可正向调控多种肿瘤细胞的生长及分化增殖，并参与肿瘤细胞抗凋亡作用，关于fibulin-3在各肿瘤系统中的研究，特别是在MPM中的表达及意义也越来越受到人们的关注[14-15]。

细胞周期通过各时相中特异性的周期蛋白来调控细胞周期G1期的相关蛋白，cyclin D1的过度表达与肿瘤和癌症的发生有一定的联系，cyclin D1在细胞周期中首先被合成，并于G1中期达到高峰。Cyclin D1的主要功能是促进细胞增殖，通过结合并激活G1时期特有的周期蛋白依赖性激酶CDK4，从而推动细胞周期由G1时期进入到S时期。研究表明，SMC-1细胞中fibulin-3表达与cyclin D1呈一定的正相关[16-17]。本实验用shRNA抑制了fibulin-3在SMC-1细胞中的表达，shRNA使SMC-1细胞阻滞于S期，并且明显减少G2/M期的SMC-1细胞数，fibulin-3过表达载体组细胞的凋亡率下降，干扰载体组细胞的凋亡率上升，对SMC-1细胞周期及凋亡有重要调节作用。由此我们推断，fibulin-3基因产物通过调控cyclin D1基因转录，参与SMC-1细胞的生长和分化。RNA干扰手段直接阻断fibulin-3与目的分子的结合，可以促进肿瘤细胞凋亡，为MPM的治疗开辟新的途径。

本研究结果显示，SMC-1细胞过表达载体组fibulin-3的mRNA升高、而干扰载体组有所下降。Fibulin-3的蛋白表达与mRNA水平一致。Mesothelin是一种分子量为40 kD的细胞表面糖蛋白，其基因位于染色体1p13.3，全长8 kD，包含1 884 bp的开放阅读框，编码17个外显子及628个氨基酸，在正常胸膜、心包膜和腹膜组织上的间皮细胞及良性胸部病变中低表达，过度表达于多种实体肿瘤组织如MPM[18-19]。本研究mesothelin 的mRNA及蛋白表达基本与fibulin-3趋势一致。

综上所述，我们应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡、RT-qPCR和Western blot方法检测SMC-1细胞目的基因的表达，结果均证实shRNA能有效抑制fibulin-3的表达，fibulin-3在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。Fibulin-3既参与SMC-1细胞的凋亡，又可以调控SMC-1细胞的细胞周期，shRNA干扰能有效抑制SMC-1细胞中fibulin-3表达，为我们寻找对MPM的研究提供了实验基础。然而fibulin-3信号转导途径在对胸膜间皮瘤细胞的靶向作用尚未见研究报道，其详细的机制还需进一步的实验研究。