Galectin-9调控SHH信号通路影响结直肠癌HT29细胞凋亡*

赵 鑫，唐亚萍，陈琳琳，王淳阅，叶 峰△

(1厦门大学附属第一医院肿瘤内科， 福建 厦门 361000； 中南大学湘雅医院 2消化内科， 3肝胆外科， 湖南 长沙 410008)

结直肠癌是一个全球范围内的健康问题，其发病率和死亡率较高，随着结直肠癌早期诊断和治疗方法的不断进步，结直肠癌患者的生存率得到显著提高，但是由于结直肠癌发展速度快、恶性程度极高，其仍然严重威胁人类健康，探讨结直肠癌发病机制对于结直肠癌的治疗具有重要意义[1]。Sonic Hedgehog(SHH)信号通路是一种与肿瘤发生有关的信号转导通路，其在肿瘤组织中过度激活，抑制其激活后可以降低肿瘤细胞的生长速度，并诱导其凋亡[2]。半乳糖凝集素9(galectin-9)在人类的脾脏、外周血淋巴细胞和胸腺等免疫组织及胃和肝脏等内胚层起源组织中广泛表达。多项研究表明，galectin-9在正常组织中的表达水平高于肿瘤组织，如结直肠癌和乳腺癌等。在卵巢癌中的研究显示，galectin-9高表达可以诱导肿瘤细胞凋亡，其在卵巢癌中发挥抑制作用[3-5]。Galectin-9在结直肠癌细胞凋亡中的作用目前尚不明确。本实验用结直肠癌HT29细胞作为体外研究对象，初步探讨galectin-9对结直肠癌细胞凋亡的调控作用及机制，为明确结直肠癌的发病机制奠定基础。

材 料 和 方 法

1 材料

结直肠癌细胞系HT29购自上海素尔生物科技有限公司；pcDNA3.1-Galectin-9由上海吉玛制药技术有限公司构建；Lipofectamine 2000购自Invitrogen；PCR和cDNA合成试剂均购自Thermo Fisher；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；抗galectin-9抗体购自BioVision；抗cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH抗体购自ABGENT；SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine购自上海瀚香生物科技有限公司。

2 方法

2.1细胞分组 HT29细胞在转染前的1 d接种到24孔培养板内，细胞融合度为90%时进行细胞转染。用灭菌的PBS将细胞洗涤2次，换成不含血清的RPMI-1640培养液培养，用Lipofectamine 2000进行细胞转染。将galectin-9过表达质粒pcDNA3.1-Galectin-9和对照质粒pcDNA3.1用Lipofectamine 2000转染到细胞中。转染24 h后的细胞用600 mg/L的G418筛选阳性克隆，筛选4周后，挑选阳性克隆扩大培养。转染pcDNA3.1-Galectin-9和pcDNA3.1后的HT29细胞分别记为pcDNA3.1-Galectin-9组和pcDNA3.1组，另将没有转染任何质粒DNA的细胞作为空白对照(control)组。用real-time PCR和Western blot测定过表达的效果。

2.2Real-time PCR实验 在control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-Galectin-9各组细胞密度为90%时，按照每106个细胞中加入1 mL的TRIzol裂解液，提取细胞中的总RNA，保存在-70 ℃。取2 μg的RNA与0.5 μg的Oligo dT混合置于70 ℃孵育5 min后放置于冰上静置2 min,再添加5 μL的5×M-MLV buffer、1.25 μL的dNTP Mixture、25 U的RNase inhibitor(40 U/μL)和200 U的M-MLV(200 U/μL)，添加RNase-free dH2O至25 μL，置于42 ℃保温约2 h，在95 ℃孵育15 min后，置于冰上冷却，得到cDNA。Real-time PCR体系：25 μL的SYBR Green PCR Mix(含有4 mmol/L的Mg2+)、各1 μL的上下游引物(10 μmol/L)、0.3 μL的TaqDNA polymerase、2 μL的cDNA和20.7 μL的ddH2O。Real-time PCR程序为: 95 ℃ 120 s；95 ℃ 30 s、59 ℃ 25 s、72 ℃ 30 s，共45个循环。GAPDH为内参照。用2-ΔΔCt法计算分析各组细胞中galectin-9水平。Galectin-9的上游引物序列为5’-CGCCCCTGGACAGATGTT-3’，下游引物序列为5’-GACAGGAGGATGGACTTGGA-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-AGAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物序列为5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

2.3Western blot实验 在control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-Galectin-9各组细胞密度为90%时，以胰蛋白酶消化后，添加蛋白裂解液，每106个细胞加入500 μL的裂解液，4 ℃、12 000×g离心10 min，用移液枪取上清分装以后，保存在-20 ℃。按照常规BCA法对蛋白进行定量以后，进行电泳。常规方法配制12%分离胶以及5%浓缩胶，每个泳道中添加40 μg样品，设置电压为90 V，观察蛋白进入到底部边缘后，终止电泳。取出凝胶，进行转膜。转膜：电压设置为90 V，将转膜装置放在冰上进行，转膜2 h后，关闭电源，此时凝胶上的蛋白被转移到NC膜上。把NC膜放在提前配制好的5%脱脂奶粉的平皿中封闭，室温缓慢摇晃反应60 min。用TBST把NC膜洗涤3次以后，将NC膜放在含有1∶200稀释抗galectin-9抗体的溶液内，置于4 ℃冰箱内缓慢摇晃过夜反应，再以TBST洗膜后，至于1 ∶4 000稀释的 II 抗反应液中，置于室温条件结合2 h，同样以TBST洗膜，用ECL显色，曝光(X胶片)后，分析内参照GAPDH和目的蛋白galectin-9的吸光度(A)值。

2.4MTT法检测细胞活力 各组细胞接种到96孔细胞培养板，每孔中加入4×104个细胞。放在CO2培养箱中培养48 h以后，添加MTT溶液20 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱反应4 h，弃掉上清，添加二甲基亚砜溶液150 μL，结合反应10 min后，置于酶标仪检测490 nm处的A值,计算各组细胞存活率。存活率(%)=实验组A值÷对照组A值×100%。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡 在control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-Galectin-9各组细胞培养密度为90%时添加PBS将细胞各洗涤3次以后，加入400 μL缓冲液，分别加入Annexin V-FITC和PI约5 μL,室温中结合15 min，上流式细胞仪检测结直肠癌细胞的凋亡情况。

2.6细胞中cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH蛋白水平的测定 Control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-Galectin-9各组细胞用Western blot方法测定细胞内的cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH蛋白水平，步骤同上，cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH抗体稀释倍数分别为：1∶100、1∶600、1∶600和1∶600。

2.7SHH信号通路抑制剂cyclopamine对结直肠癌HT29细胞凋亡的影响 取转染pcDNA3.1-Galectin-9后的细胞，在实验0 h时，添加SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine(终浓度为3.0 μmol/L)，记为pcDNA3.1-Galectin-9+cyclopamine组，培养2 d后，分别检测细胞凋亡(流式细胞术)及细胞中cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH蛋白水平，步骤同上，结果以pcDNA3.1-Galectin-9细胞作为对照。

3 统计学分析

实验数据用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示。两组数据用独立样本t检验，多组间差异使用方差分析并用Bonferroni校正的t检验进行两两比较。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 pcDNA3.1-Galectin-9上调结直肠癌HT29细胞中galectin-9的表达水平

结直肠癌HT29细胞中转染pcDNA3.1-Galectin-9后，细胞中galectin-9的mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)，转染对照载体pcDNA3.1对结直肠癌HT29细胞中galectin-9的mRNA和蛋白水平没有影响，见图1。这说明成功构建了上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞株。

Figure 1.The expression level of galectin-9 in the colorectal cancer HT29 cells after transfection. A: the mRNA expression of galectin-9 in the HT29 cells after transfection; B: the protein expression of galectin-9 in the HT29 cells after transfection determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图1转染后结直肠癌细胞中galectin-9水平的变化

2 上调galectin-9诱导结直肠癌细胞凋亡和caspase-3活化

上调galectin-9表达的结直肠癌细胞凋亡率显著提高，细胞存活率降低，细胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高，caspase-3活化水平增多(P<0.05)，见图2。这说明上调galectin-9表达可以明显诱导结直肠癌细胞凋亡，降低细胞活力，促进caspase-3活化。

Figure 2.The effect of up-regulation of galectin-9 expression on the viability, apoptosis and cleaved caspase-3 protein level in the colorectal cancer HT29 cells. A: the changes of viability in the HT29 cells after galectin-9 expression was up-regulated; B: flow cytometry was used to analyzed the effect of galectin-9 over-expression on the apoptosis of the HT29 cells; C: Western blot was used to determine the effect of galectin-9 up-regulation on the protein level of cleaved caspase-3 in the HT29 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图2上调galectin-9表达对结直肠癌HT29细胞活力、凋亡和cleavedcaspase-3蛋白水平的影响

3 上调galectin-9表达降低结直肠癌HT29细胞中SHH信号通路的激活水平

上调galectin-9的结直肠癌HT29细胞中SHH信号通路关键蛋白Smo、Gli1和SHH表达水平降低，SHH信号通路激活水平降低(P<0.05),见图3。这说明上调galectin-9可以明显抑制结直肠癌HT29细胞中SHH信号通路的激活。

Figure 3.The effect of galectin-9 up-regulation on the expression of Smo, Gli1 and SHH of SHH signaling pathway-related proteins in the colorectal cancer HT29 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图3上调galectin-9表达对结直肠癌HT29细胞中SHH信号通路关键蛋白Smo、Gli1和SHH表达的影响

4 SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine抑制上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞中SHH信号通路的激活

SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine处理上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞，细胞中SHH信号通路关键蛋白Smo、Gli1和SHH的表达水平降低，SHH信号通路激活水平进一步降低(P<0.05),见图4。这说明cyclopamine可以明显抑制上调galectin-9的结直肠癌细胞中SHH信号通路的激活。

Figure 4.The effect of cyclopamine on the expression of SHH signaling pathway-related proteins Smo, Gli1 and SHH in the colorectal cancer HT29 cells with up-regulation of galectin-9 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1-Galectin-9 group.

图4Cyclopamine对上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞中SHH信号通路关键蛋白Smo、Gli1和SHH表达的影响

5 SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine诱导上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞凋亡

SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine处理上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞，细胞凋亡率和caspase-3活化水平升高(P<0.05),见图5。这说明cyclopamine可以明显促进上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞的凋亡。

讨 论

Galectins蛋白家族对β-半乳糖苷具有较强的亲和力，目前发现至少15个蛋白成员，其主要在细胞核和细胞浆中存在，参与细胞内信号转导过程，其蛋白家族成员在人体组织中广泛存在，参与炎症、血管生成、母婴耐受等多种生理和病理过程[6-8]。Galectin-9最早在研究霍奇金淋巴瘤肿瘤抗原中发现其具有调控肿瘤细胞生物学特性的作用，后续在多种肿瘤和对应的癌旁组织中发现其表达水平差异较大[9-10]。多数研究表明，galectin-9在肿瘤中的表达水平低于对应的癌旁组织，在乳腺癌、肾癌和宫颈癌等肿瘤中的研究表明，galectin-9在肿瘤中表达下调，而在白血病等肿瘤细胞中发现galectin-9表达水平增加[11-13]。目前的研究显示，galectin-9在结直肠癌中低表达，其表达水平与肿瘤的分化程度、肿瘤患者性别和年龄等无关，与肿瘤患者远端转移等有关[3, 14]。

Figure 5.The effect of cyclopamine on the apoptosis and protein level of cleaved caspase-3 in the colorectal cancer HT29 cells with galectin-9 up-regulation. A: flow cytometry was used to analyze the apoptosis of the HT29 cells with galectin-9 up-regulation before and after cyclopamine treatment; B: Western blot was used to determine the protein level of cleaved caspase-3 protein in the HT29 cells with galectin-9 up-regulation before and after cyclopamine treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1-Galectin-9 group.

图5Cyclopamine对上调galectin-9表达的结直肠癌细胞凋亡和cleavedcaspase-3蛋白水平的影响

Galectin-9具有调控肿瘤细胞凋亡作用，在胃癌和卵巢癌等肿瘤细胞中均已证实，galectin-9过表达后可以通过促进胃癌细胞中caspase-3的活化发挥促凋亡作用[5,15-17]。Caspase-3是目前研究公认的细胞凋亡的执行因子，其位于caspase凋亡反应的下游，不仅参与肿瘤细胞等病理细胞凋亡过程，还参与心肌细胞、软骨细胞等生理细胞凋亡过程，caspase-3只有被激活后才可以发挥凋亡促进的作用[18-20]。本实验表明，高表达galectin-9的结直肠癌细胞凋亡率升高，细胞中caspase-3活化水平也升高，galectin-9可诱导结直肠癌细胞凋亡，这与上述实验报道结果均表明，galectin-9能够促进肿瘤细胞凋亡，galectin-9可能在肿瘤发生中发挥抑制作用。

SHH基因定位于7q36染色体上，是人类3种Hedgehog同源基因中最为重要、研究最为广泛的一种，在人类的多种组织和器官中广泛存在，其不仅参与正常组织器官的生理功能发挥过程，还参与肿瘤和心血管系统疾病等病理过程[21-23]。Smo是一种7次跨膜的单一肽链，是SHH信号通路的重要组成部分，其可以调控Gli1的活化，参与下游靶基因的调控作用，SHH信号通路在消化系统恶性肿瘤、泌尿系统恶性肿瘤等肿瘤组织中异常激活，其参与肿瘤的发生和发展，抑制SHH信号通路可以下调肿瘤细胞的恶性表型，诱导肿瘤细胞凋亡[24-25]。SHH信号通路不仅可以直接调控肿瘤细胞凋亡，还参与多种与肿瘤相关基因调控肿瘤细胞凋亡过程，如BRD4、LKB1等[26-27]。本实验表明，高表达galectin-9的结直肠癌HT29细胞中Smo、Gli1和SHH蛋白水平降低，并且用SHH信号通路抑制剂可以协同galectin-9共同诱导结直肠癌HT29细胞凋亡，即galectin-9通过下调SHH信号通路激活水平而诱导结直肠癌细胞凋亡。

综上所述，galectin-9在结直肠癌HT29细胞凋亡中发挥促进作用，其作用机制与SHH信号通路激活受阻有关。Galectin-9在结直肠癌中可能发挥抑癌蛋白的作用，对于其是具体通过何种方式靶向调控SHH信号通路尚未研究。本实验没有在多株结直肠癌细胞中进行验证，在后续实验中会对上述内容进行探索。本实验结果明确了galectin-9对结直肠癌细胞凋亡的调控作用及机制，为阐明结直肠癌发病机制奠定了基础。