电针对受损展神经小胶质细胞分型的影响*

王 蕾, 张 毅，严红燕, 王旭东

(南通大学第二附属医院 1急诊中心， 2神经外科， 3中医科， 江苏 南通 226001)

展神经由于缺乏神经外膜、基底膜和牢固的神经束膜包被，且缺少连接神经束的结缔组织，修复存在困难[1]，而小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫吞噬细胞，在不同的微环境中可以表现为不同的细胞亚型：经典激活M1型与选择激活M2型。M1型主要诱导免疫炎症反应，但过多的炎症反应因子也会导致正常细胞的损伤及凋亡[2]; M2型小胶质细胞主要抑制机体过度的免疫反应，促进炎症修复，保证神经修复与再生[3]。作为中国传统医学重要的一种非药物治疗方法，针刺的基础研究及临床试验均发现，电针刺激受损神经可有效地提高该神经功能恢复率[4]。本研究观察电针对Beagle犬展神经损伤模型中小胶质细胞表型的影响，初步探讨小胶质细胞的活化状态对于展神经损伤治疗的临床意义。

材 料 和 方 法

1 实验动物

选用普通级健康Beagle犬(6月龄,n=20)，雌雄各半，体重(15±0.5) kg，由南通大学医学院动物实验中心提供，许可证号:SCXK(苏)2008-0010。实验动物饲养于单独的犬房，可自由走动，12 h给予光照-黑暗的周期循环模式，保证适宜的温度进行饲养，饲养2周进行实验。实验动物治疗4周取材，动物的处理遵守国家健康协会制定的实验动物使用指南。

2 实验方法

2.1展神经损伤模型的建立及分组 术前12 h禁食后注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)静脉麻醉。将Beagle犬置于手术台采取侧卧位，固定实验动物头颅，耳缘牵向尾侧固定，麻醉充分开颅后皮瓣翻向外侧，经颞肌附着处纵向切开。经颞底入路开颅，骨窗尽量靠近颅底，扩大骨窗范围从眶后到颧弓前，并沿颞骨窗下缘切开硬脑膜沿斜坡向上外方做一创口约3.5 cm×3.5 cm。向内、上方牵拉颞叶牵开脑组织，磨除岩骨前部分暴露深部的展神经。用有齿止血钳挤压夹闭展神经30 s后直视钳压处组织菲薄，切断展神经轴突但维持神经鞘膜完整性，以犬眼球呈内斜视表明造模成功，连续2周，每次持续15 min。实验分为：正常对照(control, C)组：不进行任何神经损伤处理，正常喂养对照;假手术(sham operation, S)组：仅暴露分离展神经，术中不进行神经损伤处理，缝合切口皮肤，在电针刺激时进行束缚；损伤(injury, I)组：制作展神经损伤模型，将电极插入外直肌但不进行脉冲刺激；电针处理(electroacupuncture, E)组：Beagle犬展神经损伤模型建立后进行电针刺激，插入位置与I组相同，I组同时在E组进行电针刺激时进行束缚。

2.2电针刺激 E组展神经损伤模型制作完成后将2个电极(5 F导管)分别置入神经损伤处2侧。向外方牵拉上下眼睑，在睑板与球结膜交界处充分暴露外直肌，将电极均插入外直肌，植入深度约3.0 mm，间距约4.0 mm，缝合切口固定电极。游离端自眼眶后下方引出固定，形成回路，术后连续2周给予电针刺激，，每次持续15 min。参数设置：脉冲频率为5 Hz，时程0.1 ms，强度1.0 V。

2.3细胞培养和传代 Beagle犬麻醉后，无菌操作下迅速取下犬眼内的视神经(展神经)，放在Hanks液中洗去血液，在体视显微镜下剥离神经鞘膜；用已灭菌的剪刀机械将组织剪碎，加入0.25%的胰酶后放37 ℃烘箱消化3次，每次3 min，完全培养液(基础培养液∶小牛血清∶胎牛血清=8∶1∶1)终止消化；每次将消化液经100目筛滤下，收集3次消化滤液14 000×g离心5 min，弃去上清，完全培养液重悬细胞，转入12孔板中；37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养30 min后，转移上清至新的12孔板中继续在细胞培养箱中培养；培养2周时间，待细胞平铺开，200 r/min摇床振荡4 h，取上清至新的培养皿中继续细胞恒温培养箱中传代培养。

2.4Western blot检测小胶质细胞的M1和M2标志性分子表达 所有实验动物4周取材进行Western blot检测展神经小胶质细胞标志分子的表达水平。取上述各组Beagle犬每组5只，用10%水合氯醛进行深度麻醉后，迅速用手术剪剪下展神经节段，在低温无菌冰盘上进行操作，分离出少许神经组织置于1 mL匀浆器球状部位，尽量充分剪碎组织。加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的400 μL单去污剂裂解液进行匀浆。裂解30 min后在4 ℃、 12 000×g离心10 min，取上清分装置于-20 ℃保存。提取小胶质细胞的总蛋白，通过NanoDrop定量，取40 ug蛋白进行SDS-PAGE，将蛋白以恒定电流30 mA，电转90 min转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜上，TBST洗膜3次，然后含5%TBST的脱脂奶粉以60 r/min的速度封闭60 min，加入I抗[稀释度：白细胞介素1β (interleukin 1β, IL-1β)为1∶200，诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)为1∶3 000，精氨酸酶(arginase)为1∶1 000，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)为1∶200]4 ℃冰箱孵育过夜，I抗孵育完成后TBST漂洗3次，再移至新杂交袋中，与荧光标记II抗(1∶20 000)常温孵育60 min， TBST充分清洗后以增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)法显影并拍照，进行条带灰度分析。

3 统计学分析

运用SPSS 19.0对研究数据进行统计分析。小胶质细胞M1和M2型标志分子表达水平用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 电针治疗后展神经小胶质细胞M1表型标志物的比较

4组均检测到M1特异性标志分子(iNOS和IL-1β)。I组iNOS的表达较C组比较增加(P<0.05)；而E组iNOS表达较I组明显降低(P<0.05)，同时与C组及S组比较均无显著差异。I组和E组IL-1β的表达与C组比较均增加(P<0.05)；与I组相比，E组IL-1β降低(P<0.05),见图1、表1。

Figure 1.The expression of M1 and M2 phenotype markers of abducens nerve microglia was detected by Western blot.

图1展神经小胶质细胞M1和M2表型标志物的表达

表1各组展神经小胶质细胞M1表型标志物的比较

Table 1.Comparison of M1 phenotype markers of abducens nerve microglia in each group (Mean±SD.n=5)

GroupiNOSIL-1βC0.09±0.290.01±1.05S0.11±0.930.02±1.29I 0.31±0.89∗0.09±1.15∗E 0.14±1.01△ 0.05±0.91∗△

*P<0.05vsC group；△P<0.05vsI group.

2 电针治疗后展神经小胶质细胞M2表型标志物的比较

M2特异性标志蛋白(arginase和BDNF)在4组均被检测出。与C组相比，I组和E组arginase表达均增加(P<0.05)；而E组的arginase表达较I组增加(P<0.05)。BDNF在I和E组的表达均增加(P<0.05)；而E组的BDNF较I组表达增加(P<0.05),见图1、表2。

表2各组展神经小胶质细胞M2表型标志物的比较

Table 2.Comparison of M2 phenotype markers of abducens nerve microglia in each group (Mean±SD.n=5)

GroupArginaseBDNFC0.21±1.220.04±0.07S0.25±1.140.05±1.08I 0.38±1.03∗ 0.49±0.78∗E0.67±0.89∗△0.82±0.68∗△

*P<0.05vsC group；△P<0.05vsI group.

讨 论

电针治疗通过调节炎症因子释放、改善代谢微环境，减轻损伤细胞炎症反应和抑制神经细胞凋亡从而产生神经保护作用[5-6]。目前研究主要集中在面神经和坐骨神经损伤修复，在动眼神经损伤修复亦有相关研究。同时利用电针刺激展神经麻痹亦取得了较好的疗效，但关于针刺相关研究集中在脑血管病，而在展神经修复机制研究较少[7-8]。我们前期研究显示电针刺激可以明显促进损伤的展神经恢复[9]，但机制尚不明确。

大脑主要的免疫细胞——小胶质细胞约占大脑胶质细胞总数的20%左右[10]，其中经典激活M1型表面抗原包括CD80、CD86和主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ, MHCⅡ)等，在应激状态下通过IL-1β、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)等促炎因子分泌，主要诱导iNOS合成，对神经细胞产生毒性作用[11]。而对于神经保护作用主要依靠选择激活M2型，主要参与神经细胞再生及凋亡组织细胞的吞噬清理[12]，表面抗原主要为Ym-1、CD206和arginase等，通过分泌IL-10、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、IL-4、IL-3 和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)等抗炎因子及BDNF、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)等营养因子抑制神经细胞炎症反应[13-14]。有研究表明缺血性脑卒中后分泌BDNF通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)及磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)2条信号通路发挥小胶质细胞保护作用[15]。所以我们大胆猜测BDNF在展神经细胞修复中亦发挥保护作用，本研究与之相符。另外arginase能预防细胞外基质降解，抑制小胶质细胞迁移，促进功能性突触形成而降低神经元损害[16]，是M2重要的标志蛋白之一。

本研究中我们观察电针对Beagle犬展神经损伤模型中小胶质细胞表型的影响，探索电针治疗受损展神经的修复机制。Western blot检测展神经小胶质细胞标志分子表达水平的结果中，C组与S组比较无显著差异，即可排除手术创伤对实验结果的影响。实验结果还提示电针治疗后M1型标志蛋白水平趋于对照组，而M2特异性标志蛋白较对照组明显增加。上述结果表明电针治疗能改善受损展神经的修复情况，机制可能与调控小胶质细胞M1和M2型标志蛋白表达相关。我们选择的时点不能显示出全部小胶质细胞M1和M2表型标志物的变化规律，今后的实验还需扩大检测范围和动态监测。