PCB153对半滑舌鳎的急性毒性及抗氧化酶活性的影响

韩现芹，陈永平，郭华阳，李春青，姜巨峰，高丽娜

［1.农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（天津），天津 300221；2.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东广州 510000；3.天津市水产研究所，天津300221］

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）隶属蝶形目（Pleuronectiformes）、舌鳎科（Cynoglossidae）、舌鳎属（Cynoglossus），俗称牛舌头、鳎目、鳎米，是一种暖温性近海大型底层鱼类。因其具有广温、广盐、适应范围广、个体大及生长快的特点，是我国目前最具开发潜力的工厂化和土池养殖海水品种之一。近年，随着中国经济的快速发展，生态环境遭到了严重的破坏，养殖用水污染直接关系到水产品的质量安全。各级政府、水产相关部门及广大消费者对水产品质量安全越来越重视，其中多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）具有亲脂性和难降解性、通过生物富集并沿生物链逐级扩大等特点，日益引起人们对其普遍关注。PCBs由有机氯化合物组成，有多达209个同分异构体和同系物［1］。据报道，PCBs对生物的生殖、内分泌、神经等系统危害巨大［2］，在中国造成了广泛的污染，尤其水体受到了严重污染。据调查，海河表层水体中PCBs的含量为0.31～3.11μg/L［3］，我国境内部分水体PCBs含量远远超过美国环保局的标准［4］，污染严重。

国内外关于PCBs对鱼类及水生生物的急性毒性试验已有诸多报道［5-6］，但有关PCBs对半滑舌鳎的毒性作用研究尚未见相关报道。PCB153（2，2′，4，4′，5，5′-六氯联苯）是PCBs 209个同分异构体的其中一种，本研究采用静水生物测试法研究了PCB153对半滑舌鳎幼鱼的急性毒性和抗氧化酶活性的影响，目的在于了解PCB153对半滑舌鳎幼鱼的安全浓度并初步探讨PCB153对鱼类可能的致毒机制，同时为渔业部门监测污染和保护水环境资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

半滑舌鳎于2018年3月取自天津乾海源养殖场，平均体长为（1.23±0.06）cm，体质量为（0.09±0.01）g，试验鱼在养殖场试验室水族缸暂养7 d后进行试验，试验前1 d开始禁食。

1.2 试验药品

PCB153购于上海安谱科技有限公司，纯度为99.5%。试验时添加少量丙酮为助溶剂，浓度控制在0.1%左右。预先配制成1 000μg/L母液，再根据试验需要稀释成相应的质量浓度。

1.3 试验条件

试验用水为养殖场的过滤海水，水温为23℃，pH值为6.8，盐度2.3%。试验在25 cm×40 cm×30 cm的水族缸中进行，试验期间持续充气，不投喂饵料。每一水族缸中加入5 L试验液，并随机放入受试半滑舌鳎10尾。

1.4 试验方法

1.4.1 急性毒性试验 设处理组和对照组。处理组：参照李娜等的方法［7］将PCB153配成较大质量浓度范围的溶液对半滑舌鳎进行预试验，观察48 h后，确定最高耐受质量浓度及最低全致死质量浓度。在此基础上运用等对数法，配成不同试验质量浓度，分别为PCB153溶液4.00、11.31、32.00、90.50、256.00μg/L。添加丙酮对照组（试验中所用丙酮最大浓度），根据静水法生物测试［8］，试验期间不喂食，全天持续充气，不更换药液。每个浓度3个平行，每个水族缸中加入10 L试验液，并随机放半滑舌鳎10尾，分别于24、48、72、96 h时记录死亡数量。半滑舌鳎的中毒症状主要表现为：体色发白，失去游泳能力，用解剖针碰触，无反应为死亡，即可从水中捞出。

1.4.2 慢性毒性试验 设处理组和对照组。参考OECD标准方法PCB153质量浓度范围约为LC50-48h的1/120～1/6，处理组质量浓度梯度为1、2、5μg/L，0μg/L为对照组（丙酮浓度0.1%）。每个处理组水族箱加入20 L试验液，放半滑舌鳎20尾。在暴露后24、48、72和96 h时，每组分别取3尾，迅速放入封口袋中，置-80℃冰箱保存，测定不同浓度处理组半滑舌鳎幼鱼肌肉的超氧化物歧化酶（SOD）、脂质过氧化产物丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）活性。

1.5 酶活性的测定

（1）粗酶液制备：采用预冷的生理盐水冲洗肌肉组织，再用滤纸吸去表面水分，称取适量的样品，按1 g∶10 mL加入4℃预冷生理盐水，在冰浴条件下，采用匀浆器匀浆。匀浆液于冷冻离心4 000 r/min 10 min，取上清液备用。

（2）酶活性测定：样品上清液中蛋白含量、SOD、MDA、CAT和GST测定试剂，均购自南京建成生物工程研究所，操作按试剂盒说明书进行。

1.6 数据处理

结果均表示为“平均数±标准误”。使用SPSS 19.0统计软件one-way ANVOA（单因素方差分析）对组间数据进行分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 PCB153对半滑舌鳎幼鱼的急性毒性

急性毒性结果中，不同质量浓度PCB153对半滑舌鳎造成不同程度伤害，受试个体先表现为失去平衡力，在水中侧翻或打转。持续数小时后有些个体游动变得缓慢，逐渐丧失运动能力，躺卧缸底。死亡率随药物质量浓度的增加呈上升趋势，直至全部死亡。暴露不同时间后，半滑舌鳎幼鱼的死亡情况见表1。4.0μg/L处理组48 h开始出现死亡；256.0μg/L处理组72 h内全部死亡。

通过记录各试验组半滑舌鳎24、48、72、96 h死亡数，以计算平均死亡率，通过转换成概率单位［9］，计算出试验液质量浓度对数。用直线内插法，以质量浓度常用对数为横坐标，死亡率概率单位为纵坐标，求出概率单位与试验液质量浓度对数的回归方程。求出半数致死质量浓度LC50及各自95%可信限，采用常规方法96 h LC50×0.1计算安全质量浓度为0.928μg/L（表2）。按照毒性分级标准（表3），PCB153对半滑舌鳎为剧毒物质。

表1 半滑舌鳎在不同质量浓度的PCB153溶液中的急性致死率

表2 PCB153对半滑舌鳎急性毒性试验数据的线性回归分析

表3 有毒物质对鱼类的毒性标准［10］

2.3 PCB153对半滑舌鳎幼鱼SOD活性的影响

由图1可知，与对照组相比，3个处理组24 h后SOD活性升高到第一个高峰并出现极显著性差异（P＜0.01），诱导率分别为22.7%、102.0%和116.0%；随着暴露时间的延长，48 h后达到第二个高峰（P＜0.01），诱导率分别为190.0%、208.0%、311.0%。72 h后开始回落，2、5μg/L处理组SOD活性仍被极显著诱导（P＜0.01），1μg/L处理组SOD活性低于对照组（P＜0.01），抑制率为18.4%。96 h后2、5μg/L处理组SOD活性逐渐恢复至对照组水平，1μg/L处理组SOD活性继续降低。由此可见，SOD活性主要表现为先诱导后抑制。

2.4 PCB153对半滑舌鳎幼鱼CAT活性的影响

由图2可知，与对照组相比，暴露24 h内CAT活性未见明显变化，但在48 h时5μg/L处理组CAT活性开始被极显著诱导（P＜0.01），诱导率为71.8%；随着暴露时间的延长，各处理组CAT活性显著上升，诱导率为65.6%、101.0% 和169.0%；3个处理组CAT活性上升程度与PCB153处理质量浓度呈正相关（r2＝0.989 4）。96 h后其活性呈现出不同程度的下降趋势；1、2μg/L处理组降低到对照组水平之下，均被极显著抑制（P＜0.01），抑制率为33.0%和13.9%。5μg/L处理组CAT活性有所降低，但仍表现为极显著诱导（P＜0.01），诱导率为12.5%。由此可见，CAT活性虽然诱导有所延迟，但主要趋势表现为先诱导后抑制。

2.5 PCB153对半滑舌鳎幼鱼MDA含量的影响

由图3可知，与对照组相比，1μg/L处理组24 h时MDA含量极显著降低（P＜0.01），降低了29.0%；2、5μg/L处理组MDA含量极显著升高（P＜0.01），分别增加了12.0%和32.6%。48 h后1μg/L处理组MDA含量继续极显著降低（P＜0.01）；2 μg/L处理组MDA含量仍极显著升高（P＜0.01）；5μg/L处理组MDA含量恢复至对照组水平。随暴露时间的延长，72 h后1μg/L处理组MDA含量逐渐恢复到对照组水平；2、5μg/L处理组MDA含量开始呈下降趋势，表现为极显著降低（P＜0.01）。96 h后1μg/L处理组MDA含量继续上升；2、5μg/L处理组MDA含量仍表现为极显著降低（P＜0.01）。由此可见，1μg/L处理组MDA含量主要表现为先降低后升高的趋势，2、5μg/L处理组MDA含量主要表现为先升高后降低。

2.6 PCB153对半滑舌鳎幼鱼GST活性的影响

由图4可知，与对照组相比，1μg/L处理组GST活性在暴露24 h后被显著抑制（P＜0.05），抑制率为6.76%；2、5μg/L处理组GST活性均被显著或极显著诱导，诱导率为8.78%和26.30%。随着暴露时间的延长，各处理组GST活性继续上升，除1μg/L组与对照组仍无显著差异外，2、5μg/L处理组GST活性达到第一个高峰，诱导率分别为17.3%和50.0%；72 h后各处理组GST活性迅速上升到第二个高峰。96 h后各处理组迅速降低，恢复到对照组水平。由此可见，1μg/L处理组GST活性主要表现为先抑制后诱导的趋势，2、5μg/L处理组GST活性主要表现为先诱导后抑制。

3 讨论

3.1 PCB153半滑舌鳎幼鱼的的致死效应及安全质量浓度评价

本研究结果得出，PCB153对半滑舌鳎96 h半致死质量浓度为9.28μg/L。PCBs对斑马鱼（Barchydanio rerio var.）的影响研究中，张凤君等发现在PCBs质量浓度为50μg/L水体中，斑马鱼28 d时呈现出了明显的中毒特征，但未出现死亡个体［11］。PCB153对大型溞（Daphnia magna）LC50-48h为579μg/L［9］。据报道，无脊椎动物对多氯联苯的LC50为3.2～2 400.0μg/L，而鱼类为1.2～61.0 mg/L［12］。由此可见，不同生物对同一毒物的毒性忍耐力不同，同一生物对不同毒物的忍耐能力也不同；长期暴露于含有PCB153的养殖水环境中，可能会使许多生物群体造成不同程度的损伤。更严重的是，由于PCBs有高度的残留性，这就有可能通过食物链传递将PCBs转移至次级消费者，从而使PCBs逐渐富积，最终对人类产生巨大的危害。有研究表明，含卤化合物对水生动物毒害作用有较强瞬间毒性和腐蚀性［13］，主要通过其在水体中挥发出刺激性可溶气体及其与水中物质化合形成的毒副物质，对水生动物的呼吸中枢、内脏和体表产生刺激伤害引发，具体的毒性机制还有待进一步研究。

3.2 PCB153对半滑舌鳎幼鱼SOD活性的影响

鱼体在受到胁迫后，非特异性免疫防御系统会被激活，用来清除异物。SOD作为抗氧化防御系统的第一道防线，是清除阴离子的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应生成过氧化氢和氧气［14］，其基本功能是清除生物体内过高浓度的超氧阴离子自由基。在正常的生理条件下，SOD的生物生成量可及时满足清除自由基的需要，但在衰老及病态下，氧自由基的生产与清除则会失去平衡。在本研究中暴露于PCB153的半滑舌鳎SOD活性均显著性升高，并在48 h达到顶峰，这表明半滑舌鳎在受胁迫初期时，鱼体抗氧化防御系统被激活，来提高鱼体的免疫功能，是生物对污染的适应性反应。各处理组SOD活性变化幅度与处理液中PCB153质量浓度呈正相关，这与研究大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris）暴露于10μg/L多氯联苯，其SOD活性结果［15］相一致；而SOD活性的持续升高对降低PCB153对组织细胞的氧化损伤有一定积极作用，这说明在防御组织氧化损伤方面，SOD活性的升高可能是一种主动的也是有效的途径［16］。

随暴露时间的延长，SOD活性呈现先升高后降低的现象，这可能是因为毒物在生物体内低浓度时会导致生物体酶活性升高，而在高浓度时会导致酶活性降低［17］。另外，对剑尾鱼的研究表明，暴露48 h后，50μg/L PCBs试验组的肝组织SOD活性与对照组相比显著降低（P＜0.05）［18］，这也进一步证明了多氯联苯在生物体内的高浓度积累会使SOD活性受到抑制。

本研究还发现各处理组SOD活性在处理后72 h时均急剧下降，这可能是因为鱼类器官组织在受到PCBs重度胁迫时，药物对动物体的作用已超过机体的适应能力，体内积累过量的活性氧，导致动物体受到伤害［19］。

3.3 PCB153对半滑舌鳎幼鱼CAT活性的影响

CAT作用是清除过氧化物酶体内长链脂肪酸代谢产生的H2O2［22］，它是机体面临氧化胁迫时的一个重要代谢途径。本研究表明，各处理组CAT活性在24 h时，与空白对照组相比无显著变化；在48 h时5μg/L处理组CAT活性被极显著诱导（P＜0.01），72 h后各处理组CAT活性均被诱导，其中，2、5μg/L处理组CAT活性被极显著诱导（P＜0.01）；96 h后CAT活性较72 h时有所降低，其中1、2μg/L处理组均被极显著抑制（P＜0.01）。

CAT活性表现为先升高后降低趋势，这与SOD先诱导后抑制的结果相互印证，仅时间上呈现出一种滞后性，分析是由于PCB153胁迫，导致机体内高浓度超氧阴离子不断产生，在SOD催化下产生大量H2O2，进而机体面临氧化胁迫而产生高浓度CAT，使得CAT呈现的先诱导后抑制的时间滞后性，也可能是由于半滑舌鳎对PCB153需要一个适应过程，促使CAT活性随暴露时间延长或SOD分解H2O2含量增多而增加，以增强机体消除活性氧自由基的功能。这与报道恩诺沙星对鲫鱼过氧化氢酶活性的影响和鲱（Sprattus）仔鱼所得出的CAT活性与多氯联苯呈正相关结果［23-24］相一致。

3.4 PCB153对半滑舌鳎幼鱼MDA含量的影响

MDA是脂质过氧化作用的典型产物，其含量高低反映了机体细胞受到自由基攻击的程度［25］。1μg/L处理组MDA含量在24 h时被显著抑制（P＜0.05），到72 h时恢复与空白对照组相当水平，96 h后被显著诱导（P＜0.05）；而2、5μg/L处理组MDA含量在24 h时，均被显著诱导（P＜0.05），48 h时5μg/L处理组MDA含量恢复至与空白对照组相当水平，72 h后2、5μg/L处理组MDA含量与空白对照组相比均被极显著抑制（P＜0.01），表现出先诱导后抑制作用。符合典型的Hormesis现象［26］，即在低剂量胁迫时表现为有益作用，而在高剂量时表现出负面影响。正如轮虫在低浓度克百威环境中繁殖能力较正常环境中高［27］，这可能是由于1μg/L处理组PCB153刚进入鱼体内发生氧化应激的结果，机体存在自我修复自由基造成氧化损伤的机制，对PCB153带来的可逆性氧化损伤快速适应的结果。2μg/L和5μg/L组对MDA含量的影响与SOD活性相一致，即先诱导后抑制，这是因为机体组织内过量的超氧阴离子会使过氧化-抗氧化防御系统失衡，引发脂质过氧化反应产生MDA，导致自由基对生物体系的损伤并使生物膜变性，致使组织破坏和老化，表现为细胞膜破裂，胞质内次级溶酶体大量增加及细胞内脂肪代谢异常。

3.5 PCB153对半滑舌鳎幼鱼GST活性的影响

GST是一类催化谷胱甘肽与多种疏水性化合物的亲电子基团相连接的Ⅱ相代谢酶［28］，这种连接作用是生物体进行脱毒和排毒的重要方式，具有消除体内自由基和解毒双重功能［29］，对抗外来物质和氧化代谢副产物。本研究中，在暴露初期，1μg/L处理组GST的活性在暴露24 h后被显著抑制（P＜0.05），随着时间延长，48 h后逐渐恢复至对照水平，72 h后被显著诱导（P＜0.05），说明在短时间内，1μg/L处理组PCB153可显著抑制GST的活性，而随时间增长，方可诱导GST活性，这是由于机体暴露于有机污染物时，初期GST活性被抑制时，表示为机体对化学挑战的特异性反应［30-31］，而后又诱导GST，表明此时已激活细胞防御。

2、5μg/L处理组GST活性在暴露24 h后被显著诱导（P＜0.01），在72 h时达到最大值，96 h时各处理组GST活性逐渐恢复到初始水平。说明在短时间内，2、5μg/L处理组的PCB153可显著诱导GST的活性，而随着暴露时间的延长，鱼体体内积累了较多的氧化产物，导致GST活性逐渐受到抑制。这与已报道的研究结果相一致，多种鱼暴露于多氯联苯、多环芳烃和某些杀虫剂时，肝GST活性增加［32-33］。虹鳟（Oncorhynchus mykiss）暴露于低含量（＜3 000 ng/g）PCB后［34］，消化盲囊和鳃丝的GST活性均呈激活状态，而暴露于高含量（3 000 ng/g），GST活性均先升后降，且鳃丝GST活性变化幅度更显著。

4 结论

综上所述，SOD活性被诱导且维持在较高水平；而CAT（1、2μg/L处理组）活性在48 h内始终低于对照组；GST活性虽然与SOD活性变化趋势相一致，但不如SOD活性波动幅度大；1μg/L处理组MDA含量是先降低后升高，与2、5μg/L处理组MDA含量变化趋势相反。由此可见，半滑舌鳎SOD对PCB153的敏感性比较强，SOD活性的变化可以作为环境污染早期预警指标的参考。