褪黑素预处理提高多年生黑麦草抗旱性的机理分析

李本峰，杜红梅

（上海交通大学设计学院，上海 200240）

水资源短缺已成为全球共同面对的难题，通过一定的方法和手段来提高植物的抗旱性不仅可以有效应对水资源短缺的问题，还有利于植物的生产和推广。多年生黑麦草(Lolium perenne)是一种优质的牧草和草坪草，但由于需水量大，抗旱性差，影响了多年生黑麦草在生产中的推广和应用。因此，采用一定的措施提高多年生黑麦草的抗旱性，并分析其抗旱性提高的机理，具有重要的意义。褪黑素(melatonin, MT)是一种色胺类小分子物质[1-2]。现已证明，所有的高等植物、低等植物和植物的主要器官，如花、叶和果实等都含有MT[3]。MT在植物中的主要作用是调节植物的生长发育、维持细胞膜的稳定性、抑制叶绿素的分解和提高机体的抗氧化能力等[2]。

关于MT在草坪上的应用研究，Shi等[4]利用不同浓度的MT预处理狗牙根(Cynodon dactylon)，再进行胁迫处理，发现 20 μmol·L-1的 MT 溶液显著提高了狗牙根对于盐胁迫、干旱胁迫和冷胁迫的抗性，这可能与MT处理显著降低了胁迫后期的活性氧含量，提高了过氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性，并且上调了与氮代谢、碳水化合物代谢、三羧酸循环相关的基因的表达有关。在干旱胁迫下，随着细胞失水，植物会主动积累一些渗透调节物质，以维持渗透平衡，减少胁迫损伤。这些渗透调节物质主要是小分子化合物，包括氨基酸、有机酸和糖等。近年来，许多技术，例如气相色谱(gas chromatography,GC)、液相色谱、高分辨率的核磁共振和质谱(mass spectrometry, MS)技术，已经被成功用于干旱胁迫条件下差异代谢产物的分析。在这些方法中，GC-MS不仅简单，而且分辨率高[5]。关于干旱胁迫条件下，MT处理对多年生黑麦草过氧化胁迫以及代谢产物积累的影响，以及与多年生黑麦草抗旱性的关系，未见报道。通过前面试验发现，MT预处理对多年生黑麦草的抗旱性有显著影响，其中 25、50、75 μmol·L-1MT 溶液在干旱胁迫前连续浇灌3 d，可以显著提高多年生黑麦草的抗旱性 ， 但 25、 50、 75 μmol·L-1处 理 之 间 无 显 著 差异[6]。因此本研究选取 25 μmol·L-1MT 溶 液 预 处理，从过氧化清除机制以及代谢产物积累角度，分析MT预处理提高多年生黑麦草抗旱性的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料及生长条件

选用北京克劳沃种子公司提供的进口多年生黑麦草品种‘百灵鸟'(千粒重为2.3 g)。将草种均匀撒播于直径16 cm、深14 cm、底部带有出水口的塑料花盆中，每盆播种1g，播种基质体积比为2∶1的园土和河沙，每立方米基质混入1 kg的复合肥 (N∶P∶K=15∶6.5∶8.3)。发芽后，置于上海交通大学农业与生物学院农业工程训练中心的温室大棚内培育60 d，温室白天温度为15～25 ℃，夜晚温度为15 ℃，相对湿度为60%～80%，光照强度为600μmol·(m2·s)-1。生长过程中，每周修剪2次，留茬高度为6 cm，浇水2次，浇至有水从排水口中排出为止。每周浇1次1/2Hoagland's营养液，每次每盆浇150 mL。然后移至人工气候箱(HP1000GS型，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内，适应7d后开始试验处理，气候箱内温度为 (25±1)℃/(20±1)℃(昼温/夜温)，相对湿度60%，光周期14h，光照强度 320 μmol·(m2·s)-1。

1.2 试验方法

选取长势一致的黑麦草，随机分为4组，每组重复4次，每盆1个重复，开始进行褪黑素处理，对照和处理的MT溶液浇灌量均为100 mL。褪黑素处理期间，为了保证干旱处理和对照的一致性，停止浇灌Hoagland's营养液，并按照留茬高度，对不同处理统一进行修剪。

对照处理（CK）∶以 0 μmol·L-1MT 溶液连续浇灌3 d后，开始正常的灌水；处理MCK：以25 μmol·L-1MT溶液连续浇灌3d后，进行正常的灌水；处理 D：以0μmol·L-1MT 溶液连续浇灌3d后，停止灌水，开始干旱处理；处理MD：以25μmol·L-1MT溶液连续浇灌3d后，开始干旱处理。干旱处理11 d后复水。在干旱处理的0、4、11d和复水后的第1天，取多年生黑麦草的倒数第2片叶测定相关指标，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、抗氧化酶活性以及代谢产物分析的样品冻存在-80 ℃冰箱中。

1.2.1 褪黑素溶液的配置

称取 0.232 g MT，溶解至 5 mL 100% 的酒精中，再加入去离子水，定容至 250 mL，配成 4 mmol·L-1的 MT 母液，再用去离子水稀释成 25 μmol·L-1的MT溶液。同时加入 0.05% (V∶V)的吐温-20 ℃[7]。

1.2.2 相关生理指标的测定

草坪质量 (turf quality, TQ)用来评价草坪草的总体质量表现[8]，具体从草坪草颜色、均一性、密度和质地来评定，采用9分制。0分代表死亡、干枯的草坪草；9分代表绿色、紧致、完美的草坪草；6分代表草坪质量可以接受。光化学效率(photochemical chemical efficiency)， 即 光 系 统 II最大光化学量子产量，是可变荧光与最大荧光的比值，用Fv/Fm来表示。将材料放在暗室中暗适应30 min后，采用双通道调制叶绿素荧光仪(Dual-PAM-100, 德国 WALZ公司)的荧光成像系统，利用DualPAM软件对整盆植株进行荧光成像，取所有像素点的均值作为该盆植株的Fv/Fm[9]。叶片的相对 含 水 量 (relative water content, RWC)采 用 Barrs和Weatherley[10]描述的方法进行测定。采用Blum和Ebercon[11]的方法，用不同处理时间叶片的电解质外率 (electrolyte leakage, EL)表示相对电导率的大小。

1.2.3 丙二醛和抗氧化酶活性测定

将冻存的多年生黑麦草样品0.25 g液氮研磨后，采用pH 7.8的磷酸缓冲液提取，低温离心后，上清液用于可溶性蛋白、MDA含量和抗氧化酶活性分析。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[12]。采用硫代巴比妥酸法，测定不同处理条件下叶片中的MDA的含量[13]。SOD活性测定参照Giannopolitis和Ries[14]的方法进行。SOD酶活性的表示方法为，吸光度560 nm条件下，抑制NBT光还原50%为一个酶活性单位。CAT和 POD活性测定参照 Chance和 Maehly[15]、Du等[16]的方法进行，CAT活性的表示方法为吸光度每分钟变化1视为一个酶活性单位，POD活性的表示方法为吸光度每分钟变化0.1视为一个酶活性单位。

1.2.4 代谢产物的提取、分离和定量

将冻存的叶片样品0.1 g置于研钵中，加入适量的液氮研磨成冻干粉，待液氮完全挥发，分次加入3 mL 80%甲醇提取液研磨成匀浆，转入到10 mL 的离心管中，再加入 30 μL 2 mg·mL-1的核糖醇，充分振荡后，70 ℃ 水浴 20 min，然后 5 000 g离心 10 min，吸取 1.5 mL 上清液至 10 mL 离心管中，再加入1.4 mL蒸馏水和0.75 mL氯仿，充分振荡后，吸取上清液1.6 mL至HPLC管中，浓缩(LNGT88台式快速离心浓缩干燥器，太仓市华美生化仪器厂)干燥。浓缩干燥后加入 80 μL 15 mg·mL-1甲氧胺吡啶，密封置于30 ℃恒温箱中甲氧基化1.5 h。甲氧基化结束后，加入 80 μL BSTFA∶TMCS(99∶1)，80 μL 吡啶，70 ℃ 硅烷化 1 h。

GC-MS方法根据Qiu等[17]的方法并稍加修改。硅烷化后的样品用美国安捷伦公司7890-5975型GCMS 联用仪进行分析。色谱柱为 DB-5MS (30 m ×0.25 mm × 0.25 μm)。不分流进样，进样量 1 μL。GC进样口温度260 ℃，稳定5 min。色谱柱起始温度 80 ℃，样品注入 2 min 后色谱柱温度以 5 ℃·min-1的速度上升到 280 ℃。离子源温度200 ℃。载气为氦气，载气流速 1 mL·min-1。溶剂延时 3 min，电子碰撞电离电压70 eV，质谱全扫描范围(m/z∶30-550)进行检测。

GC-MS分析得到的总离子流色谱图，采用安捷伦公司NIST 2011谱库进行检索。使用核糖醇作为内标，计算代谢产物的相对含量。

1.3 数据统计及分析

试验采用完全区组设计。应用SPSS软件，在P= 0.05的水平上，采用Fisher's最小显著差数法对试验结果进行统计分析。文章中的图采用SigmaPlot 10.0 软件绘制。

2 结果与分析

2.1 对多年生黑麦草草坪质量、光化学效率和叶片相对含水量的影响

在干旱处理4 d时，干旱处理组草坪草的TQ显著下降 (P＜0.05)，处理至 11 d 时，TQ 继续下降，而在复水后干旱处理组的TQ上升。与不加MT的处理相比，干旱处理条件下，25 μmol·L-1的 MT 溶液预处理显著增加了多年生黑麦草的TQ(图1)。与TQ的变化趋势一致，长时间的干旱胁迫显著影响了多年生黑麦草的Fv/Fm和RWC(P＜0.05)，而在干旱胁迫条件下，25 μmol·L-1的 MT 溶液预处理显著抑制了干旱胁迫对多年生草坪草Fv/Fm和RWC的

影响。复水后，25 μmol·L-1的 MT 溶液预处理又显著促进了Fv/Fm和RWC的上升(P＜0.05)，与干旱处理组相比，25 μmol·L-1的 MT 溶液预处理后，复水后Fv/Fm和RWC分别增加了54.85%和125.36%。

2.2 对多年生黑麦草细胞膜稳定性和丙二醛含量的影响

电解质外渗的增加一般被认为是植物细胞膜受到破坏的结果。干旱胁迫条件下，多年生黑麦草叶片的EL值显著增加(P＜0.05)，尤其是在干旱胁迫 11 d 时，而 25 μmol·L-1的 MT 溶液预处理显著抑制了干旱胁迫条件下EL值的上升(P＜0.05)。在干旱胁迫4 d和11 d时，与干旱处理组相比，25 μmol·L-1的 MT溶液预处理后，EL值分别下降27.02%和13.89%。而在复水后，与干旱处理组相比，25 μmol·L-1的 MT 溶液预处理后 EL 值显著降低 (P＜0.05)，比对照组下降了 56.50%(图 2)。MDA是衡量细胞膜过氧化的重要指标。干旱胁迫导致了多年生黑麦草叶片中MDA积累，而MT处理一定程度上减少了叶片中MDA的积累。在干旱胁迫11 d和复水1 d后，与干旱处理组相比，MT处理显著降低了叶片中MDA的含量(P＜0.05)，分别降低了58.85%和65.08%(图2)。

图 2 褪黑素溶液预处理对多年生黑麦草叶片电解质外渗和丙二醛含量的影响Figure 2 Effect of melatonin pretreatments on electrolyte leakage and malondialdehyde content in the leaves of perennial ryegrass (Lolium perenne)

2.3 对多年生黑麦草抗氧化相关酶活性的影响

25 μmol·L-1MT 溶液预处理显著影响了干旱胁迫条件下多年生黑麦草抗氧化相关酶的活性。干旱胁迫4 d时，与未干旱处理相比，干旱处理组多年生黑麦草的 SOD 活性显著增加 (P＜0.05)。11 d的干旱胁迫导致了SOD活性显著下降(P＜0.05)；

复水 1 d ，SOD 活性回升。在干旱胁迫 4 d、11 d和复水1 d时，MT预处理均显著增加了多年生黑麦草的 SOD 活性 (P＜0.05)(图 3)。干旱处理组的CAT 活性在 4 d 和 11 d 时显著下降 (P＜0.05)，25 μmol·L-1MT溶液预处理显著抑制了干旱胁迫下CAT 活性的下降 (P＜0.05)。复水 1 d 后，干旱处理后的CAT活性的变化不明显，而MT处理组的CAT活性比干旱处理组增加了126.17%(图3)。干旱处理4 d显著增加了多年生黑麦草的POD活性(P＜ 0.05)。 与 对 照 相 比 ， 11 d 的 干 旱 胁 迫 对POD 活性没有显著影响 (P＞0.05)。在 4 d 和 11 d 干旱胁迫下，与未添加MT的干旱处理相比，MT预处理均显著增加了叶片中的POD活性(P＜0.05)。复水 1 d 后 POD 活性显著增加 (P＜0.05)，与对照相比，干旱胁迫条件下，不添加MT和MT预处理后，POD活性分别增加56.59%和146.79%(图3)。

图 3 褪黑素溶液预处理对多年生黑麦草超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性的影响Figure 3 Effect of 25 μmol·L-1 melatonin pretreatment on the superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities of perennial ryegrass (Lolium perenne)

2.4 对多年生黑麦草代谢产物积累的影响

采用 GC-MS 的方法，从干旱胁迫 4 d、11 d 和复水后1 d的叶片中筛选出100种化合物。其中，有机酸占30%，氨基酸占24%，糖醇类占30%，其他化合物占16%。采用偏最小二乘判别分析(Partial least squares-discriminate analysis, PLS-DA)的方法分析了MT处理对干旱胁迫条件下多年生黑麦草代谢产物积累的影响，结果表明，灌溉和干旱处理组可以很好的分离，而随着处理时间的延长，CK和MCK两组之间的差异减少。与灌溉相比，在干旱胁迫条件下，MT对代谢产物积累的影响比较大，尤其是在11 d和复水1 d的情况下。这与生理指标以及抗氧化酶的分析结果一致(图4)。

图 4 褪黑素溶液预处理对多年生黑麦草干旱胁迫 4 d、11 d和复水1 d叶片中代谢物总量变化的偏最小二乘判别分析Figure 4 Partial least squares-discriminate analysis of the metabolic profiles of leaves of perennial ryegrass (Lolium perenne) after 4 days (A) and 11 days (B) of drought stress and after 1 day of rewater with 25 μmol·L-1 melatonin pretreatment

根 据 变 异 权 重 系 数 (Variable importance in the projection, VIP)，选择VIP大于1的代谢产物重点关注。表1、表2和表3分别为干旱胁迫4 d、11 d以及复水1 d时叶片中VIP值大于1的代谢产物列

表 1 干旱胁迫4 d多年生黑麦草气相色谱-质谱检测化合物相对含量Table 1 The relative levels of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry of perennial ryegrass (Lolium perenne) after 4 days of drought stress

表 2 干旱胁迫11 d多年生黑麦草气相色谱-质谱检测化合物相对含量Table 2 The relative levels of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry in perennial ryegrass (Lolium perenne) after 11 days of drought stress

表。在干旱胁迫 4 d、11 d 和复水 1 d，分别筛选出VIP大于1的代谢产物40种(表1)、36种(表2)和35种(表3)。和灌溉的对照相比，计算关键化合物相对含量的变化，计算方法为(处理的相对含量-CK相对含量)/CK相对含量 × 100%。同时，以相对含量变化幅度大于50%或小于50%，MCK和MD有相同的变化趋势，筛选MT影响多年生黑麦草抗旱性的关键代谢产物。在干旱胁迫4 d时，筛选出8种代谢产物，分别是谷氨酸、葡萄糖胺、脯氨酸、缬氨酸、赤藓糖醇、异亮氨酸、2-氨基庚二酸和葡萄糖(表1)。在干旱胁迫11 d时，筛选出4种代谢产物，分别是亮氨酸、奎宁酸、丙氨酸甲酯和天冬酰胺(表2)。在复水1 d时，筛选出8种代谢产物，分别是乙二醇、琥珀酸、赤藓酮糖、糠醇、鸟氨基、异亮氨酸、甘氨酸和尿素(表 3)。

表 3 复水1 d多年生黑麦草气相色谱-质谱检测化合物相对含量Table 3 The relative levels contents of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry in perennial ryegrass(Lolium perenne) after 1 day of rewater after drought stress

3 讨论与结论

3.1 改善抗旱相关生理指标，提高抗氧化酶活性，提高多年生黑麦草的抗旱性

25 μmol·L-1MT 溶液预处理可以显著增加干旱胁迫条件下多年生黑麦草的TQ(P＜0.05)，也有利于复水后TQ的回升，提高干旱胁迫条件下多年生黑麦草的品质。Fv/Fm是衡量植物光合效率的重要指标，在本研究中观察到，25 μmol·L-1MT 溶液预处理显著提高了干旱胁迫和复水后多年生黑麦草的Fv/Fm(P＜0.05)，有利于维持叶片正常的光合作用，提高多年生黑麦草对干旱的抗性。叶片RWC是评估植物内部水分含量和水分缺失程度的重要指标。与Fv/Fm的变化趋势一致，MT预处理有利于降低干旱胁迫对叶片RWC的影响。干旱胁迫致使植物细胞发生脂质过氧化，产生MDA，破环细胞膜的结构，导致细胞液和离子外渗，提高植物组织的相对电导率[18]。在本研究中，在干旱胁迫4 d和11 d，都观察到干旱处理组EL值和MDA含量的显著上升(P＜0.05)，但MT预处理显著抑制了EL值和MDA含量的上升速率(P＜0.05)。而复水后，MT处理又有利于细胞膜结构的修复。说明，25 μmol·L-1MT 溶液预处理能够维持干旱胁迫条件下多年生黑麦草细胞膜的稳定性。

干旱胁迫会导致植物组织中活性氧的积累，破坏细胞的结构，影响细胞的代谢[19]。而SOD是清除超氧阴离子(O2·-)的特异性酶[20]。干旱胁迫4 d时，干旱处理组SOD活性的增加可能是一种特异性的诱导反应，以清除过量的O2·-。而在 11 d 和复水1 d时，干旱处理组SOD的活性显著下降(P＜0.05)，这可能是由于长期的干旱胁迫导致SOD部分失活，但 25 μmol·L-1MT 预处理显著增加了干旱胁迫和复水后SOD的活性(P＜0.05)。CAT是一种重要的 H2O2清除酶，干旱胁迫 4 d和 11 d，25 μmol·L-1MT 预处理显著抑制了 CAT 活性的下降速率 (P＜0.05)。而复水 1 d，MT 预处理又显著促进了CAT活性的增加(P＜0.05)。POD可以分解细胞内H2O2、胺类和酚类等有害物质。在本研究中，干旱胁迫导致多年生黑麦草POD活性显著上升(P＜0.05)，而 25 μmol·L-1MT 预处理显著增加了干旱胁迫条件下多年生黑麦草POD酶活性的上升幅度 (P＜0.05)。综上所述，25 μmol·L-1MT 预处理通过提高干旱胁迫条件下多年生黑麦草SOD、CAT、POD活性，增加细胞活性氧的清除能力，维持细胞膜系统的稳定性，提高光化学效率，延缓叶片的衰老，增强细胞的保水能力，从而提高多年生黑麦草的抗旱性。

3.2 提高渗透调节物质的表达，提高多年生黑麦草的抗旱性

氨基酸是蛋白质的重要组成成分，在植物的代谢过程中具有不可替代的作用，同时很多氨基酸含量的高低与植物非生物胁迫抗性具有一定的相关性。在本研究中总计检测到24种氨基酸，与MT作用相关的氨基酸有8种，其中，脯氨酸、异亮氨酸和鸟氨基含量的变化最明显。与干旱对照相比，25 μmol·L-1MT 预处理 4 d 提高了脯氨酸的相对含量，而脯氨酸在植物的渗透调节、自由基清除和维持细胞膜的稳定等与植物抗性相关的功能中具有重要作用[21]，这一结果也与相关的生理指标相对应。异亮氨酸是重要的支链氨基酸，干旱条件下，豌豆(Pisum sativum)[22]、小麦(Triticum aestivum)拟南芥(Arabidopsis thaliana)的叶片中都发现了异亮氨酸的积累。MT处理条件下，异亮氨酸的含量增加，可能和能量代谢有关[23]。鸟氨酸是脯氨酸生物合成的前体，在复水1 d，鸟氨酸的积累可能和脯氨酸的代谢有关(表3)。

受MT影响，含量发生显著变化的有机酸主要是奎宁酸和2-氨基庚二酸。奎宁酸是一种重要的渗透调节物质，已有的研究表明，西班牙栓皮栎(Quercus suber)自然干旱[24]和北美黑杨(Populus deltoides)人为干旱条件下[25]，奎宁酸的含量显著增加。奎宁酸参与苯丙氨酸代谢[26]。在本研究中，MT预处理条件下，奎宁酸积累可能和苯丙氨酸的高表达有关(结果未显示)。干旱胁迫下，Carmo-Silva等在狗牙根和结缕草(Zoysia japonica)的叶片中也发现了2-氨基庚二酸[27]，而关于2-氨基庚二酸的生理功能以及与MT处理的关系，未见报道。

干旱胁迫影响糖和糖醇的表达。在本研究中，MT预处理后，含量变化最显著的是赤藓酮糖。在对照以及干旱胁迫条件下，MT预处理都增加了赤藓酮糖的含量。赤藓酮糖是糖酵解的中间产物，赤藓糖醇是赤藓酮糖的前体。赤藓酮糖也是维生素C的降解产物之一[28]，而在MT影响下，赤藓酮糖积累的原因还有待进一步分析。MT预处理显著增加了灌溉和干旱条件下尿素和葡萄糖胺的含量。Shi等[4]也发现了干旱胁迫前用MT预处理显著增加尿素的含量。尿素的积累可能主要是用于多胺类物质的合成。Naeem等[29]发现了干旱胁迫条件下，鹰嘴豆(Cicer arietinum)叶片中的葡萄糖胺下降。而关于MT预处理影响葡萄糖胺积累的生理机制，还有待进一步分析。

综上所述，25 μmol·L-1褪黑素预处理可能主要通过提高干旱胁迫条件下多年生黑麦草异亮氨酸、脯氨酸、鸟氨基、奎宁酸、2-氨基庚二酸、赤藓酮糖、尿素和葡萄糖胺等相关代谢产物的积累，增强多年生黑麦草的渗透调节能力和抗氧化能力等，进而提高多年生黑麦草的抗旱性。