两株外生菌根真菌对盐渍土壤中黑松幼苗生长的影响

温祝桂，朱小梅，刘 冲，赵宝泉，董 静，邢锦城，赵小慧，洪立洲

（江苏沿海地区农业科学研究所，江苏 盐城 224002）

全球盐渍土面积约为9.5×108hm2，占陆地面积的7.3%，我国是盐渍土分布较广泛的国家之一，其面积约3.6×107hm2，占据全国可利用面积的4.9%。由于大部分植物在土壤含盐量为0.3%时便受到危害，大于0.5%时即不能生长，可见，土壤盐渍化已成为限制当地农业发展的一个重要因素。因此，改良、合理利用盐渍土地，加快盐渍土壤的植被恢复，是解决土地资源利用、改善生态环境的重要课题。

黑松Pinus thunbergii，常见于海边防护林，其在延海岸线等造林困难地段也能成林生长[1-2]。作为典型的菌根树种，黑松也是我国用于盐碱滩涂造林的优选树种，被引种于山东、江苏等沿海地区。虽黑松有一定的耐盐性，但近期我们对江苏沿海地区松林调查的结果显示，新移植的苗木存在存活率较低的现象，可见，除了松苗本身，外界的一些因素也影响着它们在盐渍土壤中的定植。因此，研究黑松定植于沿海盐渍土壤的生理生化机制成为研究的一个重点。黑松属于菌根营养型植物且菌根依赖性极强，Kataoka等[3]的研究表明，在日本鸟取沙丘地区，90%以上的黑松幼苗根部被外生菌根真菌侵染，可以想象，菌根真菌在沿海地区黑松定植扮演着重要的角色。

菌根是自然界土壤微生物与高等植物根系形成的一种具有特定形态结构和功能的共生体，两者在长期共存中互惠互利、协同进化[4-5]。大量研究表明，外生菌根真菌在增强树木抗盐性方面具有重要作用，如：通过改善宿主体内元素平衡[6-8]、水分的吸收和利用[9]、组织渗透调节能力[10-12]、提高植物根系活力[13]和光合效率[14-15]等途径提高宿主幼苗在盐渍土壤中的定植、生存能力。因此，本研究以2种外生菌根化处理的黑松幼苗为研究对象，分析其定植于高盐度（0.46%）滨海滩涂土壤中针叶叶绿素、脯氨酸以及幼苗对Na+、K+的吸收转运变化、差异，旨在探明菌根真菌对促进植物在逆境中生长及提高宿主植物耐盐性作用机理，为利用菌根技术恢复盐渍土壤森林植被提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

宿主植物：黑松；菌种：土生空团菌Cenococcum geophilum（Cg）、紫晶蜡蘑Laccaria amethystea（La）。

MMN培养基：KH2PO40.5 g/L，(NH4)2HPO40.25 g/L，CaCl20.05 g/L，NaCl 0.025 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L， 维 生 素 B1（Thiamine Hydrochloride）100 μg/L，FeCl3·6H2O 0.03 g/L 葡萄糖 10 g/L，麦芽膏 3 g/L，琼脂14 g/L，pH值5.50。121 ℃，0.1 MPa，灭菌 20 min。

土培介质：采自江苏盐城大丰金海农场（32°59′51″N， 120°49′20″E）的盐渍土，基本理化性质：pH值8.2，盐度0.46%，容重1.02 kg/m3，碱解氮37.23 mg/kg，有效磷48.12 mg/kg，有效钾343.5 mg/kg，有机质4.53 g/kg。

1.2 方 法

1.2.1 盆栽实验

幼苗准备：选取饱满黑松种子，30% H2O2表面灭菌处理10～15 min，无菌水冲洗干净，播种于装有经高温灭菌（121 ℃，0.1 MPa，120 min）处理蛭石的育苗篮中，25 ℃下培养60 d左右备用。

幼苗菌根化：选取长势一致的黑松，剪去主根，预留1 cm左右与菌块充分接触（与空白培养基接触作为未接菌空白对照）种植于土、蛭石、沙的混合培养基质（V∶V∶V=1∶1∶1）中，置于阳光房进行菌根的合成，自然光照，温控25 ℃/20 ℃（早/晚）。淋浇去离子水，以保持65±10%的相对空气湿度，培养6 mm，获得成功侵染的菌根化（Cg、La两种）以及未菌根化（NM）松树幼苗。

菌根化幼苗盆栽实验：选取长势较为一致的菌根化（侵染率相似，如表1所示。侵染率统计方法：侵染率=成功侵染菌种的根尖数量/幼苗总的根尖数×100%）和未接菌的幼苗，忽略移栽时幼苗间的差异。将上述幼苗种植于装有5.0 kg上述盐渍土壤的盆中，每盆10棵，两种苗各3盆，培植3 mm。盆栽幼苗置于阳光房中，自然光照，25 ℃/20 ℃（早/晚），适时淋浇去离子水。

1.2.2 样品收集和处理

叶绿素含量的测定：每盆中随机采集3株幼苗，称取鲜质量（Fresh Weight， FW）。取新鲜针叶0.5 g，剪成2 mm左右小段，用丙酮乙醇（V∶V=1∶1）混合液10 mL黑暗提取16 h，直至针叶颜色全部脱掉，定容至25 mL。室温下以相应试剂为参比，紫外分光光度计（岛津UV-2450）分别测定645 nm 和 663 nm处吸光度。

脯氨酸含量的测定：取上述幼苗针叶0.2 g，液氮预处理后，加入5 mL 3%磺基水杨酸研磨均匀，沸水浴中浸提10 min，10 000 rpm离心15 min，取上清液2 mL，加入2 mL冰醋酸和3 mL 酸性茚三酮溶液，混匀后于沸水浴上加热反应40 min。冷却后，加入5 mL 甲苯，振荡30 s，静置片刻，取上层液至离心管中，3 000 r/min离心5 min。吸取上层脯氨酸甲苯溶液于比色杯中，分光光度法在520 nm处测定吸光度，通过标准曲线计算样品中的脯氨酸含量。

Na、K元素测定：小心取出盆中剩余松树苗（每种处理每盆作为一个样本），以保证根部的完整性，对每一盆幼苗菌根侵染率进行统计（方法同上）后，洗净并分为地上、地下两部分，分装，70 ℃，72 h烘干、粉碎，经玛瑙研钵研细过60目筛。秤取一定质量的粉碎干样品（Dry Weight， DW），高温消解，原子吸收法分析测定K+、Na+含量。

1.3 数据处理与分析

叶绿素a含量（mg/g）：

Chl a=(12.7A663nm- 2.69A645nm)×V/(1 000W)；

叶绿素b含量（mg/g）：

Chl b=(22.7A645nm-4.68A663nm)×V/(1 000W)；

叶绿素总含量（mg/g）：

Chl a+b=Chl a + Chl b。

式中：A663nm、A645nm分别为663 nm、645 nm波长下的吸光度，V为提取液的体积，W为叶片的鲜质量。

转运系数：

转运系数=地上部离子浓度/地下部离子浓度。

采用SPSS 22.0统计软件，对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA，P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下黑松幼苗生长及菌根侵染情况

盆栽试验收苗后，幼苗侵染率及湿重，如表1所示，在盐渍土壤中，幼苗仍可以保持较高的侵染率（50%左右），但相对于实验前幼苗的侵染率，明显降低，盐胁迫可能对菌根结构的维系存在抑制作用。对试验后幼苗鲜质量进行统计发现，相对于未接菌的幼苗，接种外生菌根真可以有效提高幼苗鲜质量，其中，La菌种最为明显，提高达300%左右。同时，结果表明，接菌幼苗的成活数量得到提高。

表1 盆栽苗菌根侵染率、单株鲜质量及苗成活量Table1 Infection rate, fresh mass (FW) and seedling survival rate in pot experiments

2.2 盐胁迫下菌根侵染对黑松幼苗针叶叶绿素含量变化的影响

菌根化黑松的叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a和b的含量显著（P＜0.05，如图1）高于非菌根化黑松，但菌种Cg和La之间不存在显著性（P＞ 0.05）差异。其中，叶绿素a平均含量由不接菌的0.78 mg/g FW增加到1.27 mg/g FW（接种Cg）和1.47 mg/g FW（接种La）；叶绿素b平均含量由不接菌的0.28 mg/g FW增加到0.40 mg/g FW（接种Cg）和0.43 mg/g FW（接种La）；同时结果还表明，菌根的侵染可以提高叶绿素a/b值，由不接菌的2.75分别提高到3.17（接种Cg）和3.37（接种La）。

图1 菌根作用下幼苗针叶叶绿素含量及叶绿素a/b值Fig.1 Effects of ECM inoculation on chlorophyll content and the chlorophyll a/ chlorophyll b ratio in needles of P.thunbergii seedlings

2.3 盐胁迫下菌根侵染对黑松幼苗脯氨酸积累的影响

与上述叶绿素含量研究结构相一致，菌根化可以提高黑松幼苗脯氨酸的含量。Cg、La成功侵染的幼苗体内脯氨酸含量显著（P＜0.05，图2）高于非菌根化黑松，尤其是La的菌种侵染的（脯氨酸含量，地上部：La ＞ Cg ＞ NM；地下部：La ＞ Cg ＞ NM）。而植株体内脯氨酸含量的增加，往往是植物应对盐胁迫适应能力增强的一种表现。可见，外生菌根真菌的存在，可以更好地提高宿主幼苗的耐盐胁迫性。

2.4 盐胁迫下菌根侵染对黑松幼苗Na+、K+积累的影响

图2 菌根处理下幼苗体内脯氨酸含量Fig.2 Effects of ECM inoculation on proline content of P.thunbergii seedlings

菌根化幼苗地上部Na+含量显著高于非菌根化苗，而地下部分却相反，显著低于非菌根化苗（如图3）。菌根化（Cg、La）幼苗地上部K+含量与非菌根化幼苗相比，显著得到提高（图3A，K+含量：La ＞ Cg ＞ NM），但幼苗地下部K+含量却无显著性差异（P＜0.05，图3B）。 可见，外生菌根真菌的侵染可以有效提高K离子由地下部往地上部转运效率，减少根部对Na+的吸收。

接种菌根真菌提高地上部Na+含量的同时，也增加了K+的吸收（图3），图4可以看出菌根的存在，有效地维持（Cg菌种）或是降低（La菌种）了宿主地上部分Na+/K+的比值；而与非菌根化幼苗相比2种菌根的存在，显著（P＜0.05）降低了宿主幼苗地下部的Na+/K+的比值。有效地降低Na+/K+的比值，由不接菌的0.70降低到0.47（接种Cg）和0.64（接种La），可能就是菌根真菌提高宿主植物耐盐性的原因之一。

图3 菌根作用下幼苗体内Na+、K+含量Fig.3 Effects of ECM inoculation on Na+ and K+ accumulation in P.thunbergii seedlings

图4 菌根作用下幼苗Na+/K+值Fig.4 Effects of ECM inoculation on Na+/K+ ratio inP.thunbergii seedlings

如表2所示，菌根的侵染提高了宿主Na+转运系数（转运系数：Cg ＞ La ＞ NM）的同时，也有效提高了K+由地下部往地上部转运的能力（转运系数：La ＞ Cg ＞ NM）。

表2 不同处理下黑松幼苗Na+、K+转运系数Table2 Na+ and K+ transfer coefficients of P.thunbergii seedlings under different treatments

3 讨论与结论

众多研究表明菌根真菌（丛枝、外生）的存在，可以有效促进宿主植物对营养元素（N、P、K等）的吸收，促进宿主幼苗的生存、生长能力[4,16-20]，尤其是在逆境下[4,21-22]。菌根真菌与宿主植物有效地进行C、N以及矿质营养元素的交换，是很多植物赖以定植、生存的必要因素[4]。但由于受到逆境胁迫，菌根的形成及长时间的存在受到抑制。本研究中，在盐胁迫下，菌根的侵染率明显降低。在前期的研究中，我们也发现，外生菌根真菌的侵染率和宿主植物的生物量存在一定的线性关系（结果待发表），同时，菌根的群落结构（数量、种类、优势度等）往往影响着宿主植物的生长[20]，因此，如何加快菌根结构的形成，如何长时间维持菌根结构，保护菌根的多样性将是今后的一个研究重点，加速困难地植被恢复、重建及保护，菌根技术将会成为一个关键有效的途径。

叶片是植物进行光合作用的主要器官，其色素水平反映了植物进行光合作用的能力大小。逆境胁迫（盐胁迫）下，往往会引起过氧化作用，导致植物叶片的损伤，同时，也会引起叶绿素的降解。齐延巧[23]的研究发现，高盐胁迫下会导致枸杞叶片细胞盐离子的大量累积，破坏了叶绿体的内部结构，引起光合器官损伤、光合速率下降。因此，叶绿素含量常被用作植物耐盐胁迫的重要指标之一，而菌根化可以有效提高松树幼苗针叶中的叶绿素含量及叶绿素荧光参数[7,15]。脯氨酸含量的增加也是反映植物对盐胁迫适应能力的表现。在盐胁迫下，植物可以通过脯氨酸的积累，维持细胞内外渗透势，防止细胞因盐胁迫而失水，其次，还可以作为植物胁迫恢复时的能源物质[24]。本研究选取的能与多种木本植物共生的2种外生菌根真菌（Cg、La），与黑松形成菌根化幼苗，可以显著提高黑松针叶叶绿素a和叶绿素b的含量，这样的结论与高悦和吴小芹[7]针对6种外生菌根真菌影响马尾松、湿地松以及黑松叶绿素含量的研究结果相同。同时，Cg和La两种菌根，可以有效增加宿主植物体内脯氨酸含量，提高宿主幼苗在盐渍土壤中的定植、生长能力，提高其耐盐胁迫性。

Na+和K+是参加植物渗透调节的主要无机金属离子，因此，保持细胞内Na+/K+浓度平衡是维持植物在盐胁迫下进行正常生理代谢的关键所在[25-26]。外界高盐度存在下，为了防止细胞内物质受到高浓度Na+的毒害，胞内必须要维持较低浓度的Na+[26]；同时，植物通过积累K+，来维持细胞质中的酶活性[27]。黄艺等[28]的研究发现，接种外生菌根真菌可以降低Na+/K+，有效减少盐分对植物体的毒害。本实验中的2种菌根真菌，通过减少根部Na+的吸收来降低最易受到毒害的植物根部的Na+/K+比值，或是促进K+大量从地上往地下转运，维持或降低叶片中Na+/K+比值，调节了植物体细胞内离子平衡，提高植物的耐盐性。

综上，接种外生菌根真菌可以有效促进宿主松树幼苗的生长，菌根化使得幼苗的光合能力增强，光合产物增多，增加了植物体内脯氨酸含量；增强了K+的吸收，有效低维持相对较低的Na+/K+比。但本研究仅从外生菌根真菌改变宿主植物上述生理生化指标，促进松树幼苗的定植、生长能力，提高其耐盐性方面进行了探讨。菌根是通过什么方式调节细胞内离子平衡的？通过怎样的途径来影响宿主植物对其他营养以及微量元素的吸收与利用的？又是如何改变某些叶绿素荧光参数（如PSⅡ电子传递速率，ETR）的？这样的分子过程以及具体作用途径、作用机制还尚不明确。同时，本研究仅就单一菌种侵染进行了对比，发现促进作用与菌根真菌种类有关。众所周知，在自然界中往往是多菌种共存的，菌种之间存在着怎样的竞争机制？宿主和菌种之间又是怎样互相选择的？菌种数量以及侵染率是不是影响宿主生存能力的重要决定因素？这些问题都有待进一步深入研究。除了上述机理研究之外，不同菌种提高不同宿主植物耐盐性的技术研究，也将会成为后续菌根技术应用的一个重要方向，为沿海滩涂盐碱地的林业恢复提供理论依据及技术支持。